| 研究課題/領域番号 |
16K08105
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
村上 理都子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門 昆虫制御研究領域, 上級研究員 (10414947)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | RNA-seq解析 / 定量PCR / トランスクリプトーム解析 |
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| 研究実績の概要 |
Rice ragged stunt virus(RRSV)を保毒したトビイロウンカと保毒してないウンカを個体別にRNA-seq解析を行うと同時に、定量PCR法による個体別にRRSVの定量を行った。この結果、トビイロウンカこ体内におけるRRSVの増殖量をRibosomal protein 49 (RP49)を標準として比較した結果、1個体あたりの値に10000倍以上の差異があることがわかった。このことから、最もViral RNA / RP49値の多い3個体と少ない3個体からRNAを抽出してRNA-seq解析を行った。その結果、高保毒3虫個体全ての発現量が低保毒3個体全てのものと比較して発現量が遺伝子は250遺伝子、そのうち、タンパク質をコードしている配列を有しているのは40遺伝子であった。これらをBLAST解析した結果、36遺伝子が遺伝子、Pfam解析で24遺伝子がHitした。逆に高保毒虫における発現量が低保毒虫よりも少なかったのは196遺伝子であり、このうち、CDS配列を有していたものは60遺伝子であり、これらをBLAST検索した結果、51遺伝子がHitし、Pfam解析でHitしたのは38遺伝子であった。これらの中で、低保毒虫と比較して高保毒虫で優位に発現量が上昇したのが、DEAD-box RNAヘリカーゼファミリータンパク質とチオエステル含有タンパク質であった。これらの遺伝子は他の昆虫においてウイルス媒介と関わりがあることが示されていることから、トビイロウンカにおいてもこれらの遺伝子がRRSVの増殖に機能していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の初期においてDNAシーケンサーやイネを栽培するためのバイオトロンの不調のため、目的の遺伝子のクローニングやウイルスに罹病したイネの増殖に手間取ったため、本研究はスタートからかなり遅れてしまっていた。しかし、これらの問題がようやく解決したため、現在、本研究のペースが上がりつつあり、本来の目的に追いつくペースとなってきている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回、最もRRSVの増殖量と相関が見られたトビイロウンカ由来DEAD-box RNAヘリカーゼファミリータンパク質(DEAD-box) の全塩基配列を解読する。さらにDEAD-boxの次に相関が見られたチオエステル含有タンパク質とDEAD-box由来の二本鎖RNAを作成し、これらをトビイロウンカにインジェクションしてそれぞれの遺伝子の機能をノックダウンする（RNA interference: RNAi法）。そして、ウイルスを吸汁させ、トビイロウンカ体内においてRRSVの増殖量に影響があるのかをノックダウンしてない個体のものと比較することによって調べる。
作用していることが確認されれば、それらの遺伝のうち、どの部位が活性機能しているのかをYeast-two hybrid法やプルダウンアッセイ法等により調べる。
作用していなければ、トランスクリプトーム解析で得られた他の遺伝子について、RNAi法でウイルスの増殖に関与するかどうかを調査する。
さらに、他の昆虫においてRNAウイルスの増殖に関与することが示されている遺伝子についてもRNAi法により機能を阻害して、トビイロウンカ体内におけるウイルスの増殖に関与するのかを調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
見込んでいた人件費、旅費を使用する必要がなかったこと、機器の不調のため、試薬を必要とする実験が進まなかったため、物品費の使用が少なかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
去年度に行うことができなかった実験ができることになったので、去年度に使用されなかった人件費を今年度から使用することになる。実験もペースを上げることができる状況になってきたので、試薬、消耗品等に物品費を充てることとする予定である。
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