| 研究課題/領域番号 |
16K08138
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
高橋 征司 東北大学, 工学研究科, 准教授 (90343061)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 天然ゴム / イソプレノイド / ラテックス / パラゴムノキ / 転写制御因子 |
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| 研究実績の概要 |
天然ゴムは合成ゴムでは完全代替不可能な優れた物性を示し、タイヤ等のゴム工業製品に不可欠な天然材料であるため、遺伝子工学的手法による天然ゴム生産能の増強が期待されている。現在、天然ゴムは、パラゴムノキの乳管細胞の細胞質に相当するラテックスより生産されている。これまでに研究代表者らは世界に 先駆け天然ゴム生合成酵素およびその関連タンパク質群の同定に成功している。それらは乳管細胞内で特異的に発現しているが、その転写制御機構に関する知見はほとんど得られていなかった。本計画では、天然ゴム生合成関連タンパク質のプロモーター領域に結合する転写因子の探索と、パラゴムノキ培養細胞系をプラットフォームとした機能評価系構築により、乳管細胞において天然ゴム生合成を包括的に制御する転写制御機構を解明する。H29年度までに、ラテックスの平均化cDNAライブラリーより，ラテックス特異的に発現する天然ゴム生合成酵素およびその関連タンパク質群の5’上流プロモーター 領域に対し結合しうる転写制御因子として単離された1種類の推定転写因子の機能解析を進めた。また、遺伝子発現プロファイルをもとに、上記の候補とは別の転写制 御因子候補を単離することができた。H30年度は，これらの候補をパラゴムノキ培養細胞で過剰発現させ，その機能解明を行う予定となっており、形質転換効率の高いパラゴムノキ培養細胞系の誘導を進めていたが、培養環境に問題が発生し培養細胞系統が失われてしまった。現在までに懸濁細胞ラインの確立を再度試みているが、増殖効率の良いラインが得られておらず、2019年度まで研究期間を延長することとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
30年度は、H29年度までに絞り込まれた天然ゴムを包括的に制御しうる転写因子に関し、パラゴムノキ培養細胞で過剰発現させ、その機能解明を行う予定となっていた。そこで、形質転換ラインの作製を進めていたが、培養の環境に問題が発生し、培養細胞株が一度全て死滅してしまった。そこから新たに培養細胞株を起こすことにかなり時間がかかり、この度、研究期間を2019年度まで延長せざるを得なくなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに申請者らは、パラゴムノキの懸濁培養細胞ラインを得るため、天然ゴム生産・蓄積の場となる乳管細胞を含む葉柄の形成層からカルスを誘導する条件を確立している。その条件においては安定して増殖するカルスが得られるが、由来植物の生理的状態により、カルスを懸濁培養細胞化する際の増殖効率に差異が生じることが分かった。そこで、カルス誘導に用いる外植片として、生育ステージを細かく分けた葉柄を採取し、それらから誘導したカルスをもとに、培地条件、とりわけ植物ホルモン組成を検討し、懸濁培養細胞化を進める。
細胞増殖の観点で有望な系統が得られたのち、平成30年度までの研究において得られた候補転写因子を過剰発現させた培養細胞を作製し、天然ゴム生合成能を解析する。天然ゴム生合成能が確認された場合、Yeast two-hybrid system（Y2H）により、転写因子と相互作用するタンパク質を平均化ラテックスcDNAライブラリーよりスクリーニングする。単離された転写因子結合タンパク質の各組織別発現レベルを解析した後に、転写因子とその結合タンパク質を共発現できるバイナリーベクターを作製し、それをAgrobacterium感染法で培養細胞に導入する。過剰発現の効果を解析し、ラテックス内において天然ゴム生合成がどの様に制御されるかについて、モデルを構築するとともに、次の研究課題である代替生物における天然ゴム生合成に向けた方法論のデザインを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成30年度は、平成29年度までに絞り込まれた天然ゴムを包括的に制御しうる転写因子に関し、パラゴムノキ培養細胞で過剰発現させ、その機能解明を行う予定となっていた。そこで、形質転換ラインの作製を進めていたが、培養の環境にトラ ブルが発生し、培養細胞株が一度全て死滅してしまった。そこから新たに培養細胞株を起こすことにかなり時間がかかり、この度、研究期間を2019年度まで延長せざるを得なくなった。2019年度は、当初平成30年度に実施予定であった研究の一部を実施するため、研究費は実験消耗品（遺伝子工学試薬・キット類、オリゴDNA合成、塩基配列受託解析、培地・一般化学試薬、理化学消耗品）の購入に充てるとともに、研究成果の論文投稿費用として使用する。
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