| 研究課題/領域番号 |
16K08150
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
松井 南 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, グループディレクター (80190396)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | バイオプラスチック / 単色光 / 遺伝子発現制御 / 光レセプター / 代謝マップ |
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| 研究実績の概要 |
我々はバイオプラスチックPHA生合成のためにラン藻PCC6803に人工のオペロンを導入し生産性の向上を進めている。本研究では、我々のこれまでの研究を発展させると共に、ラン藻細胞内代謝系の遺伝子発現の単色光による制御とPHA生産に関わる影響を調べるためにラン藻の遺伝子発現の光制御地図の作成を進めた。また、PHA生産量を向上させるためにこの代謝の光制御地図を用いてPHA合成と中間代謝物を共有する代謝経路の光抑制による生産性の向上をおこなうことを進めた。
ラン藻細胞内代謝系の遺伝子発現の単色光による制御を明らかにするために、ラン藻の光応答が報告されている405, 447, 530, 590, 660, 700の６色のLEDから構成される単色光照射装置を作成した。これらの単色光は、過去の文献から生理反応に用いられている光量を用いて、ラン藻野生株に各々10umol/m2/s で３０分間照射を行い、RNA抽出を行なった。
また予備実験として白色光下で培養したラン藻をそれぞれ連続白色光、青色光、赤色光、遠赤色光、暗黒下で培養し、一定時間後ごとにRNAを抽出して特定の遺伝子の発現をqPCRにより比較した。その結果すでに光応答性が知られている光化学系の遺伝子psbA2や色素タンパク質遺伝子cpcAに加え、解糖系の遺伝子gap1やアミノ酸代謝系遺伝子のtrpA等が、明確な光質依存的な発現を示すことがわかり、第３９回日本分子生物学会で報告を行なった。
次に光レセプターの変異の影響を調べる目的で、赤色光、遠赤色光レセプターのcph1, cph2の変異体を取り寄せるとともに青色光レセプターcryptochorme の変異体を相同組み換えによる遺伝子破壊株の作成を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ラン藻の細胞内の代謝を単色光によって制御するために光レセプターの吸収波長である400から700 nmにわたる６種類のLEDを同一基板上に複数配したLEDパネルを作成した。またこのLEDパネルを用いてラン藻に光照射を行い、RNAを抽出した。予備実験として単色光照射後のラン藻で光化学系遺伝子等の重要遺伝子が光制御を受けている結果を得た。さらにラン藻の光レセプターの破壊株による影響を調べる目的で、cph1, cph2の光レセプターの変異体を取り寄せるとともに、青色光レセプターの破壊株を相同組み換えで作るための作業を進めた。抽出したRNAを用いた発現解析からゲノム全体に関わる代謝の光マップの作成が可能になった。また光レセプターの変異体を用いたバイオプラスチック合成にすぐに着手できる状況まで完了したことから概ね予定通りに進んでいると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
単色光を短時間照射後のラン藻からRNAを抽出し、RNA-Seqを行うことで、光シグナルにより誘導される直接的な光による発現誘導を、全遺伝子を対象に解析する。またcph1, cph2の光レセプター変異株及びSyn-Cryptochrome 遺伝子の欠損変異体を用いることで、それぞれの光レセプターがこれらの遺伝子発現制御に関わるかを調べる。NphT7PhaBPhaC 人工オペロンを導入したラン藻を明暗サイクル条件で培養を行い、一定時間間隔でサンプリングを行うことで概日リズムよるPHAの生産の影響を調べる。これらの情報を総合して、ラン藻を用いた物質生産に及ぼす光波長、光周期条件について解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
シアノバクテリアの代謝光制御マップ作成において、６種類の単色光を照射できるパネル作成が１０月に完成したが、予備実験としてのqPCRで単色光による光化学系遺伝子発現の解析まで行っているものの、ゲノム全体を対象としたRNA-Seq解析までに至っていない。光による代謝マップのためには実際に光照射を行なったのち、RNA-Seqによる解析を繰り返し行うことで信頼性をあげる必要がある。この光代謝マップのためのRNA-Seqを完成させるために前年度に検討した条件での遺伝子発現実験を繰り返しおこなうため、研究費の繰越しをおこなう。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度はシアノバクテリアに単色光を照射して光合成関連を含め種々の遺伝子発現変化の確認をqPCRにより行なった。本年度は、これをゲノム全体に対して行うためRNA-Seq等の方法を用いて発現解析を行う。このため前年度からの繰越しを用いてRNA-Seqを繰り返し行い、遺伝子発現の信頼性を向上させる。
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