研究課題
RRS1はTIR領域、p-loopモチーフ、ロイシンリッチリピート(LRR)配列といった抵抗性蛋白質特有のモチーフに加えて、遺伝子発現制御に関わるWRKY、ロイシンジッパー(LZ)、核移行シグナル(NLS)といった特徴的なモチーフを有している。これらモチーフにアミノ酸置換を導入し、RRS1が備えているモチーフの機能を解析した。WRKYおよびLZモチーフにアミノ酸変異を導入して機能破壊した植物体は、恒常的に抵抗反応が誘導された。一方、NLSモチーフの変異はRRS1を介した抵抗反応に影響を与えないことが明らかとなった。次いで、RRS1の構造と機能の解析を行った。RRS1のC末端領域にアミノ酸置換を導入したシロイヌナズナ形質転換体は、恒常的に抵抗反応が誘導された。以上より、RRS1の機能に重要な構造の変化はデュアル抵抗性蛋白質RPS4/RRS1複合体に影響を与え、恒常的な抵抗反応を誘導することが示された。今後は、本知見をもとに、病原体の認識に関わるRRS1のアミノ酸領域を明らかにする。また、デュアル抵抗性蛋白質RPS4およびRRS1による病原体認識後の抵抗性誘導には、EDS1が関与することが示唆されている。そこで、ゲノム編集技術により、ベンサミアーナタバコに存在するEDS1およびそのホモログを同時に破壊した植物体の取得に成功した。今後、本破壊株を用いて、デュアル抵抗性蛋白質RPS4およびRRS1をコアとした病原体の認識から抵抗性発現に至る一連の防御応答機構を明らかにする。
1: 当初の計画以上に進展している
RRS1のモチーフを機能解析するために、変異型モチーフを有するRRS1を導入した形質転換植物（シロイヌナズナ）の作製が必要である。本研究では、T2世代を用いた解析を予定していたが、安定した解析結果を得るためには、ヘテロよりもホモラインを用いた解析が重要なことから、T3世代の作製を試みた。その結果、H30年度にはT3世代(ホモライン)での解析が可能である。また、ベンサミアーナタバコへ、恒常的に抵抗性が誘導される変異型RRS1の導入を行い、形質転換体の取得に成功した。さらに、ゲノム編集技術を用いて、主要な防御シグナル伝達因子の破壊株の取得をめざしている。今年度は、RPS4およびRRS1による病原体認識後の抵抗性誘導に重要なEDS1の破壊を試みた結果、ベンサミアーナタバコのNtEDS1およびそのホモログを同時に破壊した植物体の取得に成功した。本研究は計画以上に進展している。
1) RRS1に特徴的なモチーフの機能解析…モチーフに変異を導入したT3世代のシロイヌナズナを用い、複数の病原体に対する感受度の変化を解析することで、モチーフの役割を明らかにする。同時にベンサミアーナタバコを用いた一過的発現解析により、蛋白質間相互作用を明らかにする。(2) RRS1-Rに特徴的なC末端領域の機能解析…変異C末端領域を導入した植物の表現型を解析するため、変異C末端領域を有するシロイヌナズナ形質転換体について、炭疽病菌に対する感受度の変化を解析し、抵抗性発現に関わる領域を特定する。また、前年度に特定された過敏感細胞死を指標として病原体認識および抵抗性発現に重要な領域を、ゲノム編集により作製したEDS1欠損ベンサミアーナを用いて、一過的発現解析により、シグナル伝達系を明らかにする。(3) RRS1のRNA転写バリアントを特定し、抵抗性発現に関する機能を解明…デュアル抵抗性蛋白質システムを構成するRPS4は選択的スプライシングを生じ、スプライスバリアント（splice variant）と呼ばれる変異タンパク質を生成することが知られている。他方、ストレス時に転写開始点が変化する遺伝子も知られている。現在、炭疽病菌を接種し、5日後のRRS1では新規のRNA転写バリアントの特定には至っていないことから、感染初期から複数点のサンプルを解析し、RNA転写バリアントの有無を明らかにする。(4) RRS1の仕組みを利用した病害に対する免疫力が向上した植物の創製…これまでにRRS1のロイシンジッパーモチーフへの変異、アミノ酸置換により抵抗性が恒常的に発現することを明らかにした。RRS1は抵抗性発現の制御に関わっていることが予想され、RRS1の改変により免疫力を向上した植物の創製が期待できる。最終年度は、変異型RRS1をベンサミアーナタバコへ形質転換した植物体の特徴づけを行う。
2月に3週間の入院と、その後の回復を優先したため、予定していたRRS1における新規のRNA転写バリアントの特定を次年度へ計画変更することとした。
すべて 2017
すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (8件) (うち国際学会 2件)
Genome Announcements
巻: 5 ページ: e01733～16
10.1128/genomeA.01733-16
Plant Signaling & Behavior
巻: 12 ページ: e1293218
10.1080/15592324.2017.1293218
巻: 12 ページ: e1293222
10.1080/15592324.2017.1293222
