研究課題
本年度は,我々が見出した抗体医薬bevacizumabに対する抗イディオタイプDNAアプタマーを分子認識素子とし,磁気ビーズに固定化するアプタマーアフィニティー精製法を開発した。本精製法と,高温逆相LC(HT-RPLC)-自然蛍光検出法を組み合わせることで,血中bevacizumabのバイオアナリシス法を構築した。磁気ビーズへのアプタマー固定化法について検討した結果,磁気ビーズにはストレプトアビジン修飾ビーズを用い,ビオチン修飾DNAを結合させることとした。アプタマー結合磁気ビーズからのベバシズマブの溶出条件について検討した結果,最適溶出条件として10 M尿素と3 M NaCl含有溶液を用いたときに最大の回収率を与えた。FDAのバイオアナリシスのLCガイドラインに則った分析バリデーションを取得した結果,ベバシズマブ添加血漿試料において,1 - 50 μg/mLの範囲でr2 = 0.9993と良好な直線性を示し,LOD = 0.15 μg/mL,LOQ = 0.51 μg/mLと十分な感度が得られた。また,日内変動は2.3% - 5.5%,日間変動は3.0% - 6.2%以下といずれも優れた精度を示した。さらに本アフィニティー磁気ビーズは血漿中のIgGのみならず他のIgG型抗体医薬も認識しなかったことから,本精製法がベバシズマブに対して非常に選択性が高いことが示された。今回確立した分析法は,当研究室で開発したイムノアフィニティー精製-HT-RPLC分析法のみならず,既存のトリプシン消化-LC-MS/MS分析法と比較しても簡便性,汎用性,頑健性において優位性を示すと考えられ,今後,実検体分析への投入が期待される。
2: おおむね順調に進展している
概ね予定通りに進行している。また,他の市販抗体医薬および抗体薬物複合体を特異的に認識するアプタマーについても現在探索中であり,近く候補化合物を導出予定である。
抗イディオタイプDNAアプタマーを用いるハイスループットなLBAであるEnzyme-Linked Aptamer Assay(ELAA)法を開発する。従来のELISA法などのLBAと異なり,本法では化学的に安定なDNAアプタマーをベバシズマブの捕捉分子として用いているため,抗体の質に依存しない安定な分析法となりうる。さらに,アプタマーによる抗体医薬の分子認識と酵素反応を組み合わせた,自己血糖測定器(PGM)によるポイントオブケア診断法(POCD)についても開発する。
当初の購入予定であった試薬の納期が変更になり、購入できなかったため。
前年度に購入できなかった試薬の購入に充てる。
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すべて 雑誌論文 (15件) (うち国際共著 2件、 査読あり 14件、 謝辞記載あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (15件) (うち招待講演 6件) 産業財産権 (1件)
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