| 研究課題/領域番号 |
16K08207
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| 研究機関 | 鈴鹿医療科学大学 |
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研究代表者 |
定金 豊 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (60293304)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 光反応基 / ファージ / コンファメーション病 / 分析化学 / 遺伝子工学 / アミノ酸 / 老化 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質中で繋がった状態でも、特定のアミノ酸残基は自発的に老化し、構造を変化させる。このアミノ酸の老化は修復酵素であるProtein carboxyl methyltansferase（PCMT）の働きにより多くは修復され元に戻るが、修復できない構造をもつアミノ酸は蓄積されつづけることになる。例えばアスパラギン酸（Asp）では、PCMTはD-iso体のAspを修復できないので結果として体内に特異的に蓄積し様々な疾病の一因となっていることが知られている。この現象に着目しD-isoAsp残基の解析ツールを独自の光化学的新技術で開発するのが本研究の目的である。本年度は進化分子工学と独自のクローニング法であるフォトパニング法を利用して、D-isoAsp残基の修復酵素の創生を目標に検討を行った。
【計画②】PCMTの活性部位のアミノ酸残基をランダムに入れ替え、D-isoAsp残基を認識する酵素に分子進化させるために、PCR溶液の塩条件を調整してエラー頻度の高いPCR（Error-prone PCR）を実施した。増幅断片を提示ファージに導入し、変異PCMT提示ファージライブラリーを構築した。親和性が高い基質ペプチド断片中のAsp残基について、L-isoAsp残基またはD-isoAsp残基を含むペプチドを合成し、そのN末端部位に光反応基を装着した。L-isoAsp残基を含む光反応性ペプチドでは、元のPCMTを提示させたファージを効率的に補足できることを確認した。変異PCMT提示ライブラリーについてD-isoAsp残基を含むペプチドでスクリーニングを行っているが、現在のところ親和性の高いクローンを単離するに至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
作成したL-isoAsp残基を含む光反応性ペプチドを用いてPCMT提示ファージを捕獲できることには成功したが、ライブラリーによるスクリーニングでD-isoAsp残基を認識する変異PCMT提示ファージを単離するには至っていない。光反応基を用いたフォトパンニング法は通常の方法よりも1000倍の選択効率をもつものの、Error-prone PCRによる分子進化で変異ファージをパニング法で得ることは、ターゲット部分の選定など細かい部分の調整が必要で予想以上に困難であると感じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
Error-prone PCRによる分子進化のターゲット部位をいくつか変えてライブラリーを構築し、D-isoAsp残基を認識する変異PCMT提示ファージの単離を目指す一方、既に明らかにされている立体構造情報と活性の違いを元に、ポイントミューテーション法を用いた変異PCMTの創製を目指すこととする。本酵素の創製は本研究のキーであるのであらゆる手段を講じて目的達成に注力していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）実験計画の一部が遅れているため、本年度購入予定の消耗品の一部を購入しなかったことと、参加予定であった一部の学会と公務が重なり参加できなかったため、残金が生じた。
（使用計画）購入予定であった消耗品を購入する。予定されているもの以外にも本研究を促進するために有益な学会の参加を計画する。
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