| 研究課題/領域番号 |
16K08218
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
三重 安弘 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生物プロセス研究部門, 主任研究員 (00415746)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | miRNA / Ago蛋白質 / anti-miRNAオリゴ |
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| 研究実績の概要 |
がん等の疾病に関与しているmicroRNA（miRNA）を標的とした核酸医薬が期待され、miRNA活性を阻害するオリゴ核酸，anti-miRNA oligonucleotide (AMO)，の開発が行われている。しかしながら、その作用機序の理解は進んでいない。本研究では、電極上に固定化したオリゴ核酸のダイナミクスを指標とすることで高感度な核酸-蛋白質相互作用評価法を開発し、これを応用してmiRNA-蛋白質複合体に対するAMOの作用機序を解明することを目的とする。
本年度（1年目）はまず、argonaute蛋白質（Ago）とmiRNAの複合体（Ago・miRNA）の調製を進めた。HeLa細胞から特定のmiRNAを含むAgo・miRNAを免疫沈降等により取得したが十分な収量は得られなかった。そこで、ペプチドtagを導入したAgo蛋白質の発現ベクターを準備し、HEK293T細胞を活用したAgo蛋白質の調製法を検討し、十分量の蛋白質を得ることに成功した。更に、導入したtagを利用した精製を行い純度の高いAgo蛋白質試料を調製できた。得られたAgo蛋白質に、２本鎖および１本鎖のmiRNAを作用させ、目的のAgo・miRNA複合体を得ることができたものの、該反応の効率が低く更なる改善を目指した反応条件等の検討が必要と考えている。また、核酸分子を電極上に効率的に固定化するための官能基を導入したオリゴ核酸を合成した。該オリゴ核酸を種々条件下にて金電極上に固定化し、電気化学マーカーの電圧-電流応答特性等から固定化密度の異なるオリゴ核酸電極を構築できることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ago・miRNA複合体の調製に時間を要したものの、今年度に計画していた検討内容を順調に進めることができ、次年度の計画実施に対して十分な成果・知見を得た。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度に得られた知見を基に、様々なオリゴ核酸固定化電極およびAgo・miRNA複合体を調製し、該オリゴ核酸（AMO）と該複合体との相互作用評価に最適な系の構築を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
目的の蛋白質・核酸複合体（Ago・miRNA）試料を得ることができたものの、その反応効率が低いことから、次年度に効率改善のための検討を実施することとした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上述の様に蛋白質・核酸複合体調製の高効率化を実施するため、主にそのための物品費に使用する。
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