| 研究課題/領域番号 |
16K08235
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
山崎 尚志 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学系), 准教授 (20271083)
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| 研究分担者 |
南川 典昭 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学系), 教授 (40209820)
伊藤 孝司 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学系), 教授 (00184656)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | スプライス / U1 snRNA |
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| 研究実績の概要 |
ガラクトシアリドーシスは多機能性リソソーム酵素であるカテプシンＡ(CTSA)の欠損により、糖タンパク質などに由来する糖鎖が組織に過剰蓄積する常染色体劣性遺伝病である．発生頻度は出生児10万人に１人程度と推定されているが、世界症例の60%が日本人で、日本人患者の多くでCTSA遺伝子エクソン７とイントロン７の境界付近でのaからgへの変異が見いだされている(cag/gtatggga→cag/gtgtggga．エクソン7/イントロン7)．この１塩基の変異（IVS7 +3a>g）によってエクソン７が含まれないmRNAが産生されるため正常なCTSA酵素が産生されずガラクトシアリドーシスが発症する．
mRNAはスプライスと呼ばれる反応によりmRNA前駆体からイントロンが除去されて合成される．スプライスは核内低分子RNAであるU1 snRNAがmRNA前駆体中のエクソンとイントロンの境界部位(5’ss)と塩基対を形成することで開始される．このことから、CTSAのmRNA前駆体にIVS7 +3a>g変異があると、U1 snRNAが結合できなくなるためスプライス異常が起こり、エクソン７を含まないmRNAが産生されてしまうと考えられている．申請者らはmRNA前駆体との相補性が増すように塩基を改変したU1 snRNAの発現プラスミドを構築し、これを細胞に導入すれば、IVS7 +3a>g変異を有したCTSA遺伝子からエクソン７を含んだ正常なmRNAを生じさせられることを明らかとした．そこで改変U1 snRNAによるスプライス異常修復効果の検証とその効果の向上を目指して研究を行った．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、IVS7 +3a>g変異を有したCTSAミニジーンを導入した培養細胞モデル実験系により、野生型のU1 snRNAでは変異CTSA遺伝子からエクソン７を含んだmRNAは生じないが、変異部分との相補性が増すように塩基を改変したU1 snRNAを細胞に発現させればエクソン７を含んだ正常なmRNAが生じることを明らかとした．そこでIVS7 +3a>g変異を持つガラクトシアリドーシス患者から樹立された株化細胞(ASVGS-1細胞：研究分担者の伊藤が所有)においても改変U1 snRNAによるスプライス異常修復効果が見られるかどうかを検証した．その結果、変異ミニジーンを用いたモデル実験系の場合と同様、ASVGS-1細胞においても改変U1 snRNAの発現によってエクソン７を含んだ正常なmRNAの量が顕著に増加することが示された．
また、研究分担者の南川が開発したinterigent shRNA expression device(iRed)の作製技術を用いて、ヒト組織への移行を指向した改変U1 snRNA発現ユニットを作製した．ミニジーンを用いたモデル実験系で改変U1 snRNA発現iRedのスプライス異常修復効果を検証したが、細胞にiRedを導入してもエクソン７を含んだmRNAがほとんど全く産生されないことが示された．
以上から、iRedを用いた改変U1 snRNA発現ユニットの構築に関しては期待する成果が得られなかったものの、改変U1 snRNAが対象とする変異を有するガラクトシアリドーシス患者由来細胞でも機能することが確認できたため「おおむね順調」と判断する．
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| 今後の研究の推進方策 |
予備的な実験により、CTSAミニジーンを細胞に導入すると、IVS7 +3a>g変異がなくてもエクソン７が含まれないmRNAが生じることを見いだした．スプライス反応はmRNA前駆体のエクソンとイントロンの境界部位(5’ssや3’ss)だけでなく、エクソン内やイントロン内に存在するスプライス制御配列によっても調節されており、スプライスを抑制するような制御配列の機能を阻害すればスプライスが起こりやすくなることが報告されている．そこでCTSA遺伝子イントロン７のスプライスを抑制している配列が存在する可能性を考え、これを同定し、この配列の作用を阻害するようなアンチセンスオリゴヌクレオチドと改変U1 snRNAを併用することでスプライス異常修復効果が向上しないか検証する．
また変異5’ssより下流のイントロン領域に結合できるU1 snRNA(Exon Specific U1:ExSpeU1)にスプライス異常修復効果があることが報告されている．そこで、これまでに作製した改変U1 snRNA発現プラスミドに加えて、新たにExSpeU1発現プラスミドを作製し、その効果をガラクトシアリドーシス患者から樹立された株化細胞(ASVGS-1細胞)を用いて検証する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬メーカーのキャンペーン品を購入したことなどにより支払額が僅かに少なくなったため次年度使用額が生じた．次年度の試薬類の購入にあてる予定である．
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