| 研究課題/領域番号 |
16K08241
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| 研究機関 | 岐阜医療科学大学 |
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研究代表者 |
杉山 剛志 岐阜医療科学大学, 保健科学部, 教授 (70268001)
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| 研究分担者 |
上田 浩 岐阜大学, 工学部, 教授 (50253779)
高橋 圭太 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (50634929)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 腸管出血性大腸菌 / シトロバクター・ローデンティウム / III型分泌機構 / アクチン重合 |
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| 研究実績の概要 |
III型分泌機構を利用して腸管上皮細胞に接着する細菌が粘膜免疫を誘導する際のアクチン重合の意義を検討する目的で、シトロバクター・ローデンティウムのゲノム上の遺伝子を改変して、III型分泌機構によって上皮細胞に注入されるTir（菌体の接着因子Intiminの受容体）のアクチン重合の誘導に必要なC末端側を欠失した変異体（NM株）および接着に必要な細胞外ドメインからC末端までを欠失した変異体（N株）を作製した。マウス腸管上皮細胞株CMT-93にin vitroで両株およびMock変異株（野生型）を感染させ、接着およびアクチン重合の有無を共焦点レーザー蛍光顕微鏡等を用いて確認した。菌体をDNAに結合する蛍光試薬で、Tirを蛍光抗体で、重合したアクチンを蛍光標識したファロイジンで染色して観察した結果、Mock変異株ではCMT-93細胞への接着と、その菌体に隣接するTirおよびアクチン重合が観察された。一方、MN株は接着菌量がやや少ないものの、上皮細胞への接着と菌体に隣接するTirが観察されたが、アクチン重合は観察されなかった。また、N株については接着自体が確認されなかった。
アクチン重合の遺伝子発現への影響を検討するために、アクチン重合を誘導するRhoGEFのうちKIAA0362についてToll様受容体（TLR）シグナルへの影響をin vitroで検討した。KIAA0362はTLR刺激によって活性化するTRIF依存的およびMyD88依存的シグナルを増強し、特にTRIF依存的シグナルでは転写因子であるIRF-3の核内への移行が促進されることによってシグナルを増強するメカニズムが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究代表者は平成29年度末に前所属の岐阜薬科大学を辞し、平成30年度から現所属、岐阜医療科学大学に所属を変更して本研究を継続した。変更後の施設では研究機器や設備、施設等が前施設と比較して十分ではなかったため、共同研究者所属の施設等を利用して研究を行ったが実験計画に遅延が生じた。加えて所属機関での新たな業務によって多忙となり研究時間を十分に取ることができなかった。その中で、平成30年度に計画した2種類のシトロバクター・ローデンティウム変異株の作成に成功し、in vitroの検討を行って予想通りの結果を得ることができた。この変異株を用いてin vivoの検討を行う予定であるが、変異株の作成が遅延したため平成30年度内には実験を行うことができなかった。また、腸管出血性大腸菌の変異株の作成については研究環境の変化のため遂行を断念している。また、アクチン重合の影響に関連して、RhoGEFの細胞内発現による細胞応答についての検討も一部遂行し、一定の結論を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度において作成したシトロバクター・ローデンティウムの変異株を用いて、in vivo感染実験を行い、変異株とIgA産生との関係を解析する。in vitroの検討について、平成29年度に行った、シトロバクター・ローデンティウムのマウス腸管上皮細胞株への接着による種々の遺伝子発現の検討をさらに進め、接着による遺伝子発現を確認するとともにタンパク質レベルでの発現も確認する。腸管出血性大腸菌の変異株についても可能な限り同様な検討を進める。
シトロバクター・ローデンティウムおよび腸管出血性大腸菌の接着・アクチン重合時の遺伝子発現と、Cdc42を活性化するFLJ00018、KIAA1209、KIAA0362および新規にクローン化したRhoGEF、またはCdc42類縁のRho GTPaseの常時活性型変異体を過剰発現させたCMT-93細胞を種々のTLRリガンドで刺激した場合の遺伝子発現とを比較し、類似の遺伝子発現パターンを示すRhoGEFを検索する。RhoGEFまたはRho GTPase発現の有無およびTLRリガンド刺激の有無による遺伝子発現の違いをRT-PCRおよびレポーターアッセイにより検討する。さらにその上流および下流のシグナル経路の解析を行い、in vivoの結果と合わせて特異的IgA産生との関連を考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：研究環境の変化によって実験の進行が遅れ、シトロバクター・ローデンティウムの変異株を作成については当初予定の変異株の作成には成功したが、時間的に動物実験を行うには至らなかった。その結果をもとに進める遺伝子発現の比較検討についても遅延している。したがって動物実験およびその後の検討のために使用を予定していた予算の一部を令和元年度使用額として残留した。
使用計画：シトロバクター・ローデンティウムの一連の変異株を用いた感染実験を行うために使用する。感染実験はP3A実験施設において行い、変異株をマウスへ経口摂取して約4週間、血清及び糞便を採取して抗体産生の上昇を調べる。シトロバクター・ローデンティウムの検討で抗体価の測定のほか、各消化管組織での菌の定着の度合い、免疫細胞の動向等の検討を行うための動物実験およびその解析にかかる費用として繰り越した研究費を使用する。また、その結果をもとにin vitroで行う遺伝子発現の比較検討のための費用として使用する。
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