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哺乳類の細胞では、細胞分裂期において転写がグローバルに抑制されるが、これら遺伝子は細胞分裂が完了する頃から再び発現するようになる。この転写再活性化は厳密に制御されており、ストレス応答や細胞の増殖に関わる遺伝子が優先的に再活性化されることが明らかとされているものの、その詳細な機構は不明な点が多い。本研究ではこのM/G1移行期における転写再活性化機構を明らかにすることを目的としている。
最終年度では、前年度までに同定した新規 Bookmarking 因子 GABPA の Mitotic bookmarking への関与について、より詳細に解析するため、M期特異的に GABPA が発現抑制されるシステムを構築した。これは、CRISPR/Cas9 により GABPA ノックアウト細胞を作出し、Cyclin B1 に含まれる Mitotic degron と呼ばれる配列を GABPA に付加して安定的に発現させることで達成され、GABPA の M期特異的な機能について、より詳細に解析することが可能となった。また、M期におけるGABPA の結合をゲノムワイドに解析するため、ChIP-Seq 解析を行うことを試みた。前年度に報告した通り、ChIP に使用できる抗体が入手できなくなったことと、非特異的な結合による影響を排除するため、FLAGタグを付加した GABPA を安定的に発現する細胞を作出し、抗FLAG抗体を用いた ChIP-Seq 解析を行うことに変更した。同調していない細胞からは十分な DNA が回収できたのに対し、M期で同調した細胞からは次世代シークエンス解析を実施するのに十分な DNA を得るに至らなかったため、これについては今後の課題としたい。
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