| 研究課題/領域番号 |
16K08249
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
宮川 世志幸 日本医科大学, 医学部, 講師 (90415604)
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| 研究分担者 |
内田 宏昭 東京大学, 医科学研究所, 講師 (20401250)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヘルペスウイルス / 神経特異的遺伝子発現 / インシュレーター |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではHSVベクターにおける神経特異的に転写活性が高いゲノム領域であるTerminal repeat (TR) 近傍領域に注目し、これを利用した新規のHSVベクター開発を目指している。今年度はTR領域の遺伝子発現調節機構を明らかとするため、以下の解析を実施した：①TR領域に含まれるHSV特異的インシュレーターの機能解析、②HSV特異的インシュレーター欠損HSVベクター開発とその機能解析。①について、前年度までに作製したHSV-TR領域を搭載したレポータープラスミド解析のために、ラット神経細胞初代培養系に対してリポフェクション法、エレクトロポレーション法を用いた遺伝子導入実験を実施した。しかし遺伝子導入効率、細胞生存率が伴に極めて低く、レポータープラスミドによる検討は難しいと判断した。従って、HSV特異的インシュレーターの機能解析はHSVベクターにて直接解析を行う方が良いとの結論に至り、②の同組換えHSVベクターの作製へと進んだ。本解析を行うにあたり、まず無毒化HSVベクターのTR近傍領域に存在するHSV特異的インシュレーターCTRS1/2/3-HSVを欠損した組換えHSVをそれぞれ作製し、これらのTR領域にレポーター遺伝子AcGFPを挿入した。これらベクターからのレポーター発現をウイルス産生細胞及びラット後根神経節初代培養系にて検討したところ、CTRS3欠損により遺伝子発現が有意に上昇すること、またCTRS1/2欠損すると逆に遺伝子発現が減少することを明らかとした。次にこれらインシュレーターによる遺伝子発現制御にImmediate-early遺伝子ICP0がどのように影響するか解析するために、これら各種CTRS欠損HSVベクターより更にICP0を完全に欠損させたCTRS欠損無毒化HSVベクターを作製した。現在同ベクターを用いた遺伝子発現解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はTR領域の遺伝子発現調節機構を明らかとするため、TR領域に含まれるHSV特異的インシュレーターの機能解析及びHSV特異的インシュレーター欠損HSVベクター開発を計画していた。HSV特異的インシュレーターを搭載したプラスミドによるレポーター解析は初代培養神経細胞に対する遺伝子導入の難しさから断念したが、HSV特異的インシュレーター欠損HSVベクターの開発についてはほぼ計画通り進行した。また開発したインシュレーター欠損HSVベクターの生産・大量精製も問題なく完了し、培養細胞・初代培養神経細胞に対する遺伝子導入実験まで解析が進んだ。また申請者が仮定した通り、本インシュレーターの欠損がTR領域からの遺伝子発現に深く関与するという知見萌えることができた。また同ベクターを用いたin vivoにおける発現解析についても並行して進めている。以上の結果より、多少の計画の変更を余儀なくされたものの、研究目標に向けて計画は順調に進行していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の方針として、現在進めているインシュレーター欠損HSVベクターを用いたin vitro・in vivo発現解析を完了し、いずれのインシュレーターが神経特異的遺伝子発現に重要であり、遺伝子発現カセットの挿入部位としてどこが最適か解析を進める。
また最終年度である今年度は実施計画提案通り、申請者らが以前開発したHSV糖タンパク質改変、miRNAを利用した非特異的遺伝子発現抑制についても検討し神経特異性を高めることができるか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）当初計画していたインシュレーター搭載プラスミドを用いたレポーター解析について、上記の通り計画変更を行ったため、それらに必要な経費に余剰を生じた。
（使用計画）インシュレーター欠損HSVベクターを用いたin vitro及びin vivoのレポーター解析に活用する。またqPCRを用いた遺伝子発現量定量解析の諸費用に利用する。
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