| 研究課題/領域番号 |
16K08253
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| 研究機関 | 京都薬科大学 |
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研究代表者 |
中山 祐治 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (10280918)
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| 研究分担者 |
齊藤 洋平 京都薬科大学, 薬学部, 助教 (90411032)
久家 貴寿 京都薬科大学, 薬学部, 助教 (20551857)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞分裂 / チロシンリン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
細胞分裂後期・終期における，タンパク質チロシンリン酸化の網羅的解析を目指し，当初予定していた細胞周期同調方法に加え，別の細胞周期同調方法を検討した。ヒト子宮頸癌由来HeLa S3細胞にEg5阻害剤であるSTLCを加えて培養すると，細胞は単極性の紡錘体を形成し，細胞分裂の進行が停止して細胞周期が同調した。続いてCdk1阻害剤であるRO-3306を加えると，細胞分裂を終了して次の細胞周期へと進行した。この細胞周期同調方法により，擬似的な細胞分裂後期・終期の細胞を集められることがわかった。予定していた方法に加え，この方法においても細胞周期同調を行い，プロテオミクス解析を行った。それらの結果，細胞分裂後期・終期においてチロシンリン酸化されるペプチドを複数見出した。
また，阻害剤ライブラリーを用い，細胞分裂に影響を及ぼす分子の探索を行った。直接的に細胞分裂進行に対する影響を観察するため，阻害剤を培養細胞に加えた直後から細胞をタイムラプス観察し，細胞分裂進行を観察した。さらに，フローサイトメトリーを用い，細胞周期の変化についても調べた。その結果，幾つかの阻害剤により，細胞周期進行，および細胞分裂進行が変化した。
これらの結果は，細胞分裂後期特異的なチロシンリン酸化シグナルが存在し，細胞分裂制御，特に，細胞質分裂制御に関与すること，阻害剤ライブラリーを用いた検討結果は，幾つかの阻害剤の標的分子が細胞分裂制御に関与することを示唆している。さらに，幾つかのキナーゼタンパク質も候補にあがったことから，それらの基質としてリン酸化されたタンパク質がプロテオミクス解析により検出された可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
プロテオミクス解析において，細胞分裂期後期特異的にチロシンリン酸化されるペプチドを複数見出しており，解析する分子を検討中である。また，阻害剤ライブラリーを用いたスクリーニングもほぼ終了し，影響を及ぼす阻害剤を見出すことができた。RNA干渉を用い，分子の特定を行っている。よって，概ね予定通り進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
プロテオミクス解析により，細胞分裂後期・終期にチロシンリン酸化されるタンパク質候補を見出し，また，阻害剤ライブラリーのスクリーニングにより，細胞分裂制御に関わる新規タンパク質の候補を見出した。よって，これらの候補分子について，細胞分裂制御との関連を解析する。
リン酸化ペプチドが見出された分子については，遺伝子導入による発現系を構築し，さらに変異を導入してリン酸化を確認するとともに，リン酸化部位を特定する。さらには，内在性の分子をノックダウンした上で変異体を発現させるレスキュー実験系を構築して，リン酸化の生理的意義を解析する。
阻害剤ライブラリーを用いたスクリーニングにより見出された候補タンパク質については，まず，阻害剤の特異性を確認するため，標的が同じ別の化合物により同様な表現型が観察されるか検討する。さらに，RNA干渉法により分子の特定を行う。候補タンパク質の細胞内局在，リン酸化などの翻訳後修飾の有無を解析するとともに，遺伝子発現系を構築してレスキュー実験などに用いる。
候補タンパク質の幾つかはチロシンキナーゼであり，プロテオミクス解析で見出したリン酸化ペプチドのチロシンリン酸化に関わる可能性がある。これも視野に入れながら，研究を進める。
さらに，我々が樹立した，がん遺伝子v-Srcの誘導発現が可能な細胞株を用い，リン酸化シグナル亢進が染色体分配に与える影響を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
阻害剤ライブラリーを追加購入する予定であったが，現有のライブラリーの解析において期待される結果が得られたため購入しなかった。また，プロテオミクス解析，阻害剤ライブラリーを用いた解析の結果，候補タンパク質を複数見出したが，一部，すでに保有している抗体などを利用することができたため予定額を下回った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度はさらに別の分子についても検討を進めるため，各種抗体が必要である。また，詳細に解析するために，リン酸化特異抗体，siRNA，プラスミドDNA，候補タンパク質のcDNAなどの購入に充てる。特に，リン酸化特異抗体の作成を依頼する場合は高額となる可能性がある。
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