| 研究課題/領域番号 |
16K08274
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
浅井 将 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 助教 (90383223)
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| 研究分担者 |
岩田 修永 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (70246213) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ダウン症 / アルツハイマー病 / ネプリライシン / DYRK1A / リン酸化 / 21番染色体 |
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| 研究実績の概要 |
ダウン症は、主に21番染色体がトリソミーになることに起因する。ダウン症者は40代という早期からアルツハイマー病（Alzheimer’s disease, AD）を発症し、この原因は「一次原因物質であるアミロイドβペプチド（amyloid-β peptide, Aβ）のアミロイド前駆体タンパク質（amyloid precursor protein, APP）をコードする遺伝子が21番染色体に存在するから」と考えられてきた。しかしながら、APP遺伝子に変異を有する家族性AD家系の解析からAβの産生量とADの発症年齢は必ずしも相関せず、21番染色体にAD増悪因子の存在を示唆された。
そこで本研究課題では、ダウン症の表現型に関連深い二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A（dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase 1A, DYRK1A）に着目し、Aβの主要分解酵素であるネプリライシン（neprilsyin, NEP）へのリン酸化について解析した。DYRK1Aの過剰発現によりNEP細胞内領域内の5つの推定リン酸化部位のうち、6番目のSer、11、15、25番目のThrのリン酸化が亢進した。リコンビナントDYRK1AとNEP細胞内領域部分ペプチドのin vitroキナーゼアッセイでは4つのリン酸化がすべて起きるわけではなかった。このことから、DYRK1Aはプライミングキナーゼとして作用することが示唆された。また、NEPの推定リン酸化部位のAla変異体は、野生型NEPよりも発現が亢進、または分解が抑制することがわかった。AlphaLISAによるDYRK1A阻害剤のスクリーニング系を確立するために、NEP細胞内領域にdPEG11をスペーサーとして結合させたビオチン化化合物を合成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
DYRK1Aによるネプリライシンのリン酸化部位を培養細胞およびin vitroでの試験管の実験系で同定し、AlphaLISAを利用したDYRK1A阻害剤のスクリーニング系の立ち上げの目処が立ったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
・DYRK1AおよびNEPの変異体の解析
DYRK1Aの酵素活性を除いた変異体を用いて、NEPのリン酸化および活性低下が誘導されないか解析する。また、NEPの推定リン酸化部位に変異を導入した変異体の活性および局在、半減期を野生型と比較する。
・DYRK1Aによるネプリライシンのリン酸化阻害化合物のスクリーニング
リコンビナントDYRK1Aおよびネプリライシンの細胞内領域にビオチンを付加した合成ペプチドを用いたAlphaLISAによるDYRK1Aの阻害化合物のスクリーニング系を確立し、化合物ライブラリーから新規DYRK1A阻害剤のスクリーニングを行う。スクリーニングでヒットした化合物処理による培養細胞系でのネプリライシンのリン酸化、活性、発現を解析し、既存の阻害剤と比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
所属機関を変更するにあたり、年度末に計画していた変異体の実験を翌年度に繰り越したため、この実験に関する費用について次年度使用とした。平成30年度に実施するこの実験に必要な細胞培養および遺伝子導入試薬等の購入費に充てる予定である。
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