パーキンソン病患者 iPS 細胞由来ドパミン神経におけるエピゲノム修飾機構の解析

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08280
• 研究機関: 星薬科大学
• 研究代表者: 葛巻 直子 星薬科大学, 薬学部, 講師 (10507669)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: パーキンソン病 / ヒト iPS 細胞 / ドパミン神経 / エピジェネティクス

研究実績の概要

これまでの検討により、健常者と比較し、パーキンソン病患者 (PARK2) iPS 細胞由来ドパミン神経細胞において、ドパミン代謝に重要なCOMT の著明な発現増加が認められ、パーキンソン病患者 iPS 細胞由来ドパミン神経細胞において COMT 遺伝子転写開始点直上のCpG サイトにおいて、健常者ではほぼ完全にメチル化されているのに対し、パーキンソン病患者 (PARK2) iPS 細胞由来ドパミン神経細胞では低メチル化状態にあることが明らかとなった。このような COMT 発現の亢進は、パーキンソン病患者 iPS 細胞では認められず、ドパミン神経への分化が進むにつれて顕著に認められることを明らかとした。こうした条件下、こうしたパーキンソン病患者 iPS 細胞由来ドパミン神経細胞における COMT 遺伝子の発現変化がparkin 遺伝子の変異に起因しているか否か検討する目的で、CRISPER/Cas9 システムを応用して、isogenic iPS line を作製し、検討を試みた。その結果、健常者 iPS 細胞に、PARK2 患者と同様の parkin 遺伝子の変異を挿入し、parkin 遺伝子を欠損させた isogenic iPS line をドパミン神経細胞へと誘導し検討を行ったところ、COMT の有意な発現増加が認められた。一方、ドパミン神経細胞における COMT 発現亢進に伴った器質的あるいは機能的変化を抽出する目的として、FLEX switch システムにより COMT を発現させるアデノ随伴ウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターを作製したため、表現系の解析に着手している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

parkin 遺伝子の欠失と疾患表現系の因果関係を検討する目的で、健常者 iPS 細胞に、PARK2 患者と同様の parkin 遺伝子の変異を挿入し、parkin 遺伝子を欠失させた isogenic iPS line の作製を試みたところ、順調に作製が進み、実験に応用することができた。また、in vivo での表現系解析のために作製した flex switch システムに基づいた発現ベクターの構築も進んだため、TH-Cre あるいは DAT-Cre マウスとの組み合わせにより、解析を促進することができた。このようにマテリアルの準備が順調に整ったことにより、目的の解析が可能となり、おおむね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

エピゲノム修飾変化については、isogenic iPS line を用いて引き続き検討を行っていく。また、TH-Cre あるいは DAT-Cre マウスに、flex システムに従いドパミン神経特異的に標的遺伝子を発現させ、錐体外路障害への影響について検討を行う。行動表現系の解析については、3 次元深度センサーやバランスドビームテストを始めとした装置を用いて、多角的に検討を行う。また、このような動物の黒質あるいは線条体切片を作製することにより、スライスパッチクランプを行い、機能変化についても検討する。こうした解析を行うことにより、ドパミン神経細胞における COMT 発現亢進に伴った器質的あるいは機能的変化を抽出することが可能となる。

研究成果

• [雑誌論文] Functional Neurons Generated from T Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Neurological Disease Modeling. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto T, Fujimori K, Andoh-Noda T, Ando T, Kuzumaki N, Toyoshima M, Tada H, Imaizumi K, Ishikawa M, Yamaguchi R, Isoda M, Zhou Z, Sato S, Kobayashi T, Ohtaka M, Nishimura K, Kurosawa H, Yoshikawa T, Takahashi T, Nakanishi M, Ohyama M, Hattori N, Akamatsu W, Okano H.
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 6 ページ: 422-35
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2016.01.010
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] ヒト疾患特異的 iPS 細胞技術を応用した難治性神経疾患のメカニズム解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 葛巻 直子, 須田雪明, 成田道子, 岡野栄之, 成田 年
  • 学会等名: 第90回 日本薬理学会年会
  • 発表場所: 長崎
  • 年月日: 2017-03-15 – 2017-03-17
• [学会発表] Hypomethylation of COMT gene promoter in Parkinson’s disease-specific iPS cell-derived dopaminergic neurons (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Suda，N. Kuzumaki，M. Narita，K. Igarashi，H. Takeshima，T. Ushijima，N. Hattori，H. Okano，M. Narita
  • 学会等名: 第 39回日本神経科学大会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-07-20 – 2016-07-22
• [学会発表] Multiple analysis for the DNA methylation changed in parkinson's disease specific iPSC-derived dopaminergic neurons (2016)
  • 著者名/発表者名: N. Kuzumaki, Y. Suda, K. Igarashi, M. Narita, H. Takeshima, T. Ushijima, N. Hattori, M. Suematsu, H. Okano, M. Narita
  • 学会等名: ISSCR 2016 Annual meeting
  • 発表場所: サンフランシスコ
  • 年月日: 2016-06-22 – 2016-06-24
  • 国際学会
• [学会発表] Analysis of changes in the expression of dopamine-related genes with epigenetic chenges in parkinson's disease-specific iPS cell-derived dopaminergic neurons (2016)
  • 著者名/発表者名: Y. Suda, N. Kuzumaki, M. Narita, K. Igarashi, H. Takeshima, T. Ushijima, N. Hattori, H. Okano, M. Narita
  • 学会等名: ISSCR 2016 Annual meeting
  • 発表場所: サンフランシスコ
  • 年月日: 2016-06-22 – 2016-06-24
  • 国際学会
• [学会発表] ヒト疾患特異的 iPS 細胞を用いたパーキンソン病態下におけるエピゲノム変化の解析 (2016)
  • 著者名/発表者名: 須田雪明, 葛巻直子, 成田道子, 五十嵐勝秀, 竹島秀幸, 服部信孝, 岡野栄之, 牛島俊和, 成田 年
  • 学会等名: 第10回日本エピジェネティクス研究会年会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 2016-05-19 – 2016-05-20