| 研究課題/領域番号 |
16K08314
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| 研究機関 | 徳島文理大学 |
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研究代表者 |
野路 征昭 徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (80271534)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | サイコサポニン / シトクロムP450 |
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| 研究実績の概要 |
ミシマサイコの主要薬用成分であるサイコサポニンは、2,3-オキシドスクアレンの環化により生成したβ-アミリンがシトクロムP450により酸化され、糖転移酵素による配糖体化が起こることで生合成されると考えられる。しかし、その生合成の分子機構の詳細は明らかになっていないため、サイコサポニン生合成に関わる酵素群の遺伝子、特にβ-アミリンからサイコゲニンを生合成する際に関わるシトクロムP450の単離及び機能解析を試みた。β-アミリンのC-23位の水酸化に関わると考えられるシトクロムP450を同定するために、次世代シークエンサーを用いて作成したミシマサイコの根、茎、葉のESTデータベースを検索した。オレアノール酸のC-23位を水酸化するタルウマゴヤシのMtCYP72A68v2と類似しているアミノ酸配列を持つ12種類のシトクロムP450を候補遺伝子とし、これらのcDNAの単離を試みた。これら12種類のシトクロム P450のうち、R34510、R40275、R81567、R144574、R138977、R205422、R204224、R32577の8つの全長cDNAの単離に成功した。次世代シークエンサーのデータを用いて、今回単離したシトクロムP450遺伝子のミシマサイコの各部位での発現を予想したところ、R34510、R40275を除く6つの遺伝子では、葉より根での発現が高いことが示唆された。これらcDNAを酵母で発現させ機能解析を行ったところ、R144574を発現させた酵母でβ-アミリンの水酸化体の生産が示唆された。そこで、この酵母を大量培養し、新たな代謝物を抽出、精製後、NMRにて構造を決定した。その結果、R144574はβ-アミリンおよびβ-アミリン28位水酸化体(erythrodiol)のC-23位を水酸化する活性をもつシトクロムP450であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
サイコサポニン生合成に関与すると考えられるβ-アミリンのC-23位を水酸化するシトクロムP450のcDNAの単離に成功した。このシトクロムP450, R144574は、これまでに他の植物で報告のあったオレアノール酸のC-23位水酸化ではなくβ-アミリンのC-23位を水酸化する新規性の高い酵素である。また 、ミシマサイコのESTデータベースを検索することにより、β-アミリンのC-16β位の水酸化に関与するシトクロムP450の候補cDNA, 2種類の単離に成功した。機能解析までには至っていないが、今後機能解析をおこなっていく。また、糖転移酵素の候補遺伝子の単離に成功し、また、酵母での複数遺伝子の同時発現による植物由来成分の生産に成功していることから、おおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
β-アミリンのC-16β位の水酸化に関与するシトクロムP450については、2種類の候補cDNAの単離にすでに成功しているので、今後、この遺伝子を発現させた酵母を作製することで、このシトクロムP450の機能解析を行っていく。また、糖転移酵素については、単離した遺伝子の組換えタンパク質の発現系を大腸菌を用いて構築する。また酵母によるサイコサポニン生産を試みるため、これまでに単離、機能解析に成功した3種類の外来シトクロムP450の単一酵母細胞での共発現を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
糖転移酵素について研究するために、組換えタンパク質を作製するためのベクターおよび組換えタンパク質精製用キットの購入を予定していたが、平成29年度はシトクロムP450の解析に時間がかかってしまい糖転移酵素に関する研究が十分に出来なかったため、そのための予算を使用しなかった。平成30年度には糖転移酵素の機能解析を組換えタンパク質を用いて行うため、そのための試薬等の購入に使用する。
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