| 研究課題/領域番号 |
16K08342
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| 研究機関 | 星薬科大学 |
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研究代表者 |
東 伸昭 星薬科大学, 薬学部, 教授 (40302616)
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| 研究分担者 |
安達 勇光 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所 沼津支所, 主席研究員 (00250051)
山本 典生 順天堂大学, 医学部, 准教授 (40323703)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 微生物・感染症学 / 細胞外マトリックス / 炎症 / インフルエンザウイルス / ヘパラナーゼ / 上皮細胞 / 組織修復 / ヘパラン硫酸 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題の目的は「ウイルス感染機構とその後に生じる上皮組織の障害機構を解明し、これを阻害する薬理学的手法を見出す」ことである。平成28年度は感染調節の候補分子であるヘパラン硫酸が感染の入口となり得るか否かを検討した。また組織修復におけるヘパラナーゼの関与を検討した。
前者について、インフルエンザウイルスの感染対象となる肺上皮細胞においてヘパラン硫酸の発現抑制系を構築した。他の上皮由来細胞に対して以前に適用したstealth siRNA導入プロトコールに倣い、ヒト肺上皮細胞株A549細胞においてヘパラン硫酸整合性酵素遺伝子EXT1の発現抑制を試みたところ、酵素反応の最終産物であるヘパラン硫酸の発現抑制を達成することができた。この細胞に対するin vitro感染実験を行ったところ、細胞表面のヘパラン硫酸の発現抑制に伴ってインフルエンザウイルスの感染効率が低下するという予備結果を得た。細胞表面の糖鎖全体の変化を含めさらに検討を加える必要がある。
後者について、ヘパラナーゼによって組織修復が促進される可能性を考え、細胞増殖の測定系にヘパラナーゼ阻害物質を添加し、５日後の細胞増殖を定量的に検討したところ、複数の上皮細胞株においてヘパラナーゼ阻害物質存在下で顕著な細胞増殖の抑制効果が認められた。この抑制効果は細胞を低濃度（1000個/ウェル）で播いた際に認められたが、細胞密度が高い状態では認められなかった。また顕著な細胞死は検出されなかった。内在性のヘパラナーゼが上皮細胞の増殖を促進して組織修復に関与する可能性が想定される。本検討で見出されたヘパラナーゼ阻害物質による細胞増殖抑制の分子機構の解明には至らなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
期間内に研究代表者の異動があり当初は進行が少し遅れていた。本研究課題の進行において上皮組織の障害機構を糖鎖生物学の観点から解析するために「糖鎖合成遺伝子（ここではEXT1）のsiRNAによる発現抑制系」を確立することが必須であった。以前に確立したstealth siRNAによる発現抑制法を適用することで、この点を解決するとともに、今後の感染実験の遂行の見込みを立てることができた。一方、組織修復は感染に伴う炎症応答・組織の障害に引き続いて生じる現象であるが、この修復にとって必要な細胞増殖にヘパラナーゼが関与する可能性を見出した。ヘパラナーゼの作用を組織修復を解析する手がかりとして、ヘパラナーゼ依存的な細胞増殖を支える分子機構について検討を進めたい。
異動後の研究がスムーズに進んだことから、結果として当初の予定とほぼ同様に研究を遂行することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
前半の「ウイルスの上皮細胞感染におけるヘパラン硫酸の関与」については、ヘパラン硫酸の発現抑制に伴う感染効率低下の追試を行うとともに、他の細胞株についてもヘパラン硫酸の関与を検討する。現行の系では、ウイルス感染の成立は細胞への吸着・ウイルスの取り込み・複製・ウイルス粒子の再構築・出芽など複数の過程をすべて含んだ結果として示されたものである。今後は感染の各過程に着目し、ヘパラン硫酸の発現低下が感染のどの過程に影響するのかという観点から、細胞内コンパートメントを含めた細胞レベルの解析を行う。さらに細胞表面においてヘパラン硫酸を提示するコアタンパク質を同定する。これらに並行し、in vivo感染実験の立ち上げを進める。研究代表者東と研究分担者山本で担当する。
一方、組織修復に関わるヘパラナーゼの作用について、ヘパラナーゼによる増殖促進もしくはヘパラナーゼ阻害物質による増殖抑制が上皮細胞に共通して見られる現象であるのか、細胞種を拡げて検討する。増殖制御を支える分子機構について、特に細胞周期の制御という観点から検討を加える。以前に、ヘパラナーゼ依存的な上皮細胞からの炎症物質産生という現象を見出しており、これと細胞増殖促進機構とのシグナル類似性を検討する。加えて、ヘパラナーゼ阻害/枯渇物質の探索を進める。研究代表者東と研究分担者安達で担当する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者が東京大学から星薬科大学に異動したのに伴い、動物実験など一部の実験計画については当年度の実施を見送った。このため当初予定していた研究課題のうち「炎症細胞の組織浸潤・上皮細胞を裏打ちする基底膜分解へのヘパラナーゼの関与」の研究計画に該当する物品費の購入がなくなり、そのため次年度使用額が生じた。実験環境が整ったので、平成29年度に実施することを予定したい。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度以降であるが、異動先の機関で動物実験を行う準備が進行し環境が整いつつある。次年度使用額を活用させていただき、感染マウス、組織障害マウスのモデルを用いた動物実験の立ち上げを行い、感染病態に伴う炎症の惹起による基底膜分解の組織学的観察、ヘパラナーゼ阻害物質の局所投与の効果を検討したい。これに加え、現時点で実験系が動いているin vitro感染実験、増殖試験にも注力して研究を進めたい。
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