| 研究課題/領域番号 |
16K08356
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| 研究機関 | 名城大学 |
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研究代表者 |
原田 健一 名城大学, 薬学部, 教授 (90103267)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | microcystin分解性細菌 / プロテアーゼ / 加水分解特性 |
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| 研究実績の概要 |
当研究室では、B-9株による各種ペプチド性化合物の分解挙動から湖沼生態系におけるその存在意義の解明を最終目的とし、B-9株の機能とともに貧栄養湖における栄養獲得挙動を明らかにしている。本研究では加水分解に関与する加水分解酵素MlrA, MlrB, MlrCおよびトランスポーターであるMlrDの遺伝子配列の決定、さらに遺伝子に基づくリコンビナントタンパク質の作成と酵素阻害剤の有無によるB-9による各種ペプチド類の分解挙動をHPLCおよびLC/MSで観察した。
B-9株が有するMlrA、MlrB、MlrCおよびMlrDをコードするそれぞれ遺伝子の塩基配列を解読するためにゲノムDNAを抽出し、PCR法により各遺伝子のクローニングを行った。現在まで、mlrA~Dの塩基配列はそれぞれ1011 bp、1212 bp、1450 bp、1275 bpが決定されたが、mlrCは末端部位が不完全でおり、mlrBの全長が1626 bpと報告があることから、決定されたmlrBの長さは不完全な配列であると考えられる。
新たな加水分解酵素MlrEの存在およびアミノ酸までの最終過程を明らかにするため、発色団を有するL-アミノ酸ペプチド類の分解挙動を調べた。いずれのペプチドも速やかに分解され、EDTAやPMSFの阻害実験でも、加水分解が進行することが確認された。一方、加水分解されたアミノ酸は消失せず、蓄積することから、アミノ酸に至る最終過程には新たなプロテアーゼ、MlrEがL－アミノ酸を認識して分解すること、および分解されたアミノ酸が蓄積することからアミノ酸を細胞内に取り込むアミノ酸トランスポーターが存在し、それが阻害されることを示している。この結果、B-9株にはオリゴペプチドトランスポーターであるMlrDだけではなく、アミノ酸トランスポーターも存在することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、酵素阻害剤の有無によるB-9による各種ペプチド類の分解挙動をHPLCおよびLC/MSで観察する機器分析的アプローチおよび加水分解に関与する酵素MlrA, MlrB, MlrCおよびトランスポーターであるMlrDの遺伝子配列の決定およびそれに基づくリコンビナントタンパク質を作成する分子生物学的アプローチから構成されている。前者の研究では、ペプチド類化合物を基質とし、microcystin分解性細菌B-9株との分解挙動については、良好な結果が得られていることから予定通り進行すると考えられている。後者の研究では、mlrA~Dの塩基配列はそれぞれ1011 bp、1212 bp、1450 bp、1275 bpが決定されたが、mlrCは末端部位が不完全でおり、mlrBの全長が1626 bpと報告があることから、決定されたmlrBの長さは不完全な配列で、mlr遺伝子に関する情報は少なく、また、遺伝子がクラスターとして存在し、両方とも末端の部位に位置しているため、完全な配列を得るには至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回得られた実験結果および当研究室で蓄積された知見にもとづけば、従来広く受け入れられてきたMC分解菌による分解経路は再検討せざるを得ない。特に、新たな加水分解酵素および全く手付かずのトランスポーターの機能に関する詳細な実験が必要である。今後、上述した分子生物学的アプローチと機器分析的アプローチを適宜組み合わせて実験を遂行していく予定である。計画として（1）mlrAおよびmlrDは全長の塩基配列が決定され、大腸菌BL21株とベクターpET-30aを用いてリコンビナントタンパク質を作成するとともにmlrBとmlrCの末端部位が未だ不明であることから、DNAライブラリークローニングを検討する予定である。（2）MC分解性細菌B-9は実際に分子量100~5000程度のペプチド類を分解することは既に確認されている。B-9株の加水分解の潜在能力を調べるため、現在分子量がさらに大きいタンパク質（分子量10,000程度）を用いて加水分解挙動を調べている。（3）新たな酵素MlrEの機能を明らかにするため、D-アミノ酸含有テトラペプチドを適宜に用いて分解挙動を調べる。（4）アミノ酸/ペプチドトランスポーターの取り込み状況を観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
分析に用いたHPLCカラムがキャンペーン価格で購入できたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
D-アミノ酸の購入に充てる。
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