| 研究課題/領域番号 |
16K08376
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
山崎 泰広 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (80415330)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | トランスポーター / 肝臓 / トラフィキング / 胆汁分泌障害 / 生活習慣病 |
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| 研究実績の概要 |
食の欧米化（高カロリー食中心の食生活）による過栄養状態は、生体のコレステロール恒常性を乱すことにより、動脈硬化症、脳血管疾患、心臓病、胆石症等の重篤な疾患を引き起こす。特にコレステロールの体外への主要な排泄経路である肝臓から胆管への胆汁排泄、およびそれを担う脂質トランスポーターの発現・機能変化は、これら疾患発症のメカニズムを解明するうえで極めて重要である。本研究は、栄養状態の変化や病的環境が誘発するトランスポーターのトラフィキング異常、およびそれに付随する胆汁分泌異常機構を解明するのが目的である。我々はこれまでにABCG5/ABCG8の毛細胆管膜へのトラフィキングにcAMPシグナルが関与する可能性を見出しており、2016年度はその現象にProtein kinase A （PKA）が関与するかについて検討した。まずPKA触媒サブユニットα（PKA Cα）のGFP融合タンパク発現遺伝子をハイドロダイナミック法によりマウス肝臓にin vivo導入し、マウス肝毛細胆管膜におけるAbcg5およびAbcg8タンパク質発現量を調べたところ、ともに増加していた。次に、PKA制御サブユニットIα（PKA RIα）の野生型（wt）および、触媒サブユニットが解離されない機能抑制型変異体（G324D）のFLAG融合タンパク質発現プラスミドを構築した。これら遺伝子のいずれかとAbcg5-CFP、およびAbcg8-YFP発現遺伝子を高脂肪食飼育マウス肝臓に共発現させたところ、PKA RIα（G324D）発現細胞では蛍光トランスポーターの毛細胆管膜への局在が阻害されていたのに対し、PKA RIα（wt）発現細胞ではこの阻害が見られなかった。以上の結果から、Abcg5/Abcg8の食事による肝毛細胆管膜への局在化にPKAが関与する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2016年度はABCG5/ABCG8の毛細胆管膜局在化の詳細な分子機構を調べるために、PKAサブユニットであるPKA Cα、RIαの野生型、およびRIα機能抑制型変異体を作成し、ハイドロダイナミック法でマウス肝臓にin vivo導入した。その結果、これらトランスポーターの毛細胆管膜への局在化にPKAが重要であることがわかった。次にどのPKAサブユニットが重要であるか調べるため、PKA RIIαの野生型発現遺伝子をマウス肝臓にin vivo導入したが、Abcg5/Abcg8の局在には影響を及ぼさなかった。さらにFLAG融合EPAC（Exchange Protein directly Activated by cAMP）発現遺伝子を構築し、マウス肝臓に発現させることに成功した。
リン脂質トランスポーター・ABCB4、および胆汁酸トランスポーター・ABCB11の過栄養状態における肝細胞内トラフィキングを解析するために、マウス肝臓からAbcb11、およびAbcb4をクローニングしYFP融合トンランスポーター発現遺伝子を構築した。これら発現遺伝子をマウス肝臓にin vivo導入し、導入18時間後における遺伝子産物の発現分布を確認したところ、いずれの蛍光トランスポーターも肝毛細胆管膜に局在していた。また肝ホモジネートを調製し、ウェスタンブロットで蛍光トランスポーターのバンドが検出されたことから、目的の発現遺伝子が構築されていることが確認された。
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| 今後の研究の推進方策 |
2017年度以降は、過栄養状態により誘導されるABCG5/ABCG8の膜局在化に関与する会合分子の同定を目指す。具体的にはAbcg5-YFP/Abcg8-YFPをハイドロダイナミック法により高脂肪食負荷マウス肝臓に発現させる。摘出した肝臓から肝毛細胆管膜画分、エンドソーム画分をショ糖密度勾配遠心方により調製し、抗YFP抗体でそれぞれ免疫沈降する。沈降物を質量分析計で解析し、ABCG5/ABCG8と相互作用する分子を同定する。候補となる分子が同定されたなら、FLAG融合タンパク質発現遺伝子を構築し、蛍光トランスポーターとマウス肝臓に共発現させることで、トランスポーターのトラフィキングに影響を与えるか調べる。さらにABCG5/ABCG8と会合分子の相互作用にPKAが関与するかについて検討する。
過栄養状態がABCB4、およびABCB11の毛細胆管膜局在化に及ぼす影響を調べるために、高脂肪食摂餌マウス肝臓にこれらトランスポーターの発現遺伝子を発現させ、in vivo動態解析法によりその挙動を調べる。またABCG5/ABCG8と同様にPKAサブユニットを共発現させ、発現分布に与える影響を解析する。さらに上で同定したABCG5/ABCG8会合分子がABCB4、ABCB11のトラフィキングにも影響を与えるかについて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
肝臓から抽出したtotal RNAの逆転写をするためのキットを購入する予定であったが、年度内は購入済みのもので足りたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記の逆転写用キットを購入する。
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