| 研究課題/領域番号 |
16K08390
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
児玉 進 東北大学, 薬学研究科, 助教 (20621460)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 薬物動態 / シグナル伝達 / サイトカイン / 核内受容体 / 遺伝子発現調節 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、HepaRG細胞を用いて、ヒト肝臓でのサイトカイン応答性を高く保持・反映する薬物動態関連因子（薬物代謝酵素、薬物トランスポーター）の発現変動機序のインビトロ解析モデルの検討・選定を行った。
薬物動態関連因子の肝細胞特異的な「構成的」発現及び薬物曝露に伴う「誘導的」発現におけるサイトカイン応答性の解析を目的とし、それぞれに適当な培養・処理条件を検討・選定した。次いで、それぞれの条件下、代表的なサイトカイン(IL-6、IL-1b、TNFa)の刺激に応答した主要な薬物動態関連因子及びこれらの転写制御に関わる転写因子群のmRNA発現変動を解析した。その結果、「構成的」発現の解析条件下、①何れのサイトカインも薬物動態関連因子及び転写因子の発現を普遍的に強く抑制する、②各薬物動態関連因子及び転写因子はサイトカインそれぞれに対して異なる応答性（抑制強度、反応時間）を示す、ことを見出した。とりわけ、「誘導的」発現の解析条件下、各種サイトカイン前処理後に薬物応答性転写因子（PXR、CAR）のリガンドを処理し、両転写因子の共通の標的薬物動態関連因子の発現誘導を解析した結果、サイトカインによる抑制には、転写因子のmRNAレベルでの量的変化と共に、翻訳後修飾を介した機能調節が関わる可能性が示された。また、ヒト肝癌細胞株及び大腸癌細胞株を用いて検討した結果、HepaRG細胞と比較して、薬物動態関連因子及び転写因子のサイトカイン応答性は限定的であることが明らかとなった。
これらの解析結果を受け、①インビトロ解析モデルとして適当な薬物動態関連因子及び転写因子の選定とそれらのプロモーター領域の単離及びレポーターアッセイ系の構築、②細胞内シグナル経路の阻害薬処理条件の検討、を行った。今後、これらの解析系の構築及び解析諸条件の最適化を行い、薬物動態関連因子の発現変動機構の解析を進める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、申請計画に沿い、HepaRG細胞を用いたサイトカインに応答した薬物動態関連因子の発現変動機序のインビトロ解析モデルの検討と選定に重点を置いて研究を進めた。
薬物動態関連因子の発現を肝細胞特異的な「構成的」発現と薬物曝露に伴う「誘導的」発現に大きく分けて捉え、それぞれの解析に適当な培養・処理条件（培地、培養日数、サイトカイン処理濃度、薬物処理濃度）を選定した。解析の結果、今回用いた代表的な3種のサイトカインに対して、何れの薬物動態関連因子も強く発現抑制を受けると共に、それぞれ異なる応答性を示すことを見出すことができた。また、薬物応答性転写因子は、サイトカインによってmRNA発現レベルでの量的変化と共に、翻訳後修飾を介した機能調節を受ける可能性が示された。HepaRG細胞に引き続き、ヒト肝癌細胞株HepG2及び大腸癌細胞株LS180を用いた解析条件の検討を進め、それぞれの細胞株における各種薬物動態関連因子及び転写因子群のサイトカイン応答性を確認した。これらの結果を踏まえ、インビトロ解析モデルとして適当な薬物動態関連因子及び転写因子を選定し、それらのプロモーター領域の単離及びレポーターアッセイ系の構築に着手すると共に、細胞内シグナル経路の阻害薬処理条件の検討を進めた。
以上のことから、計画当初の解析項目に小さな実施変更があるが、最終的な目的に向けて順調に研究は進行していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
基本的には、交付申請書に記載した計画に従い研究を進める。まず、本年度の研究成果を基にHepaRG細胞やHepG2細胞、LS180細胞等のインビトロ培養細胞系を軸に据え、選定した解析モデルを用いた解析系の構築及び解析諸条件の最適化を引き続き行い、サイトカインに応答した薬物動態関連因子の発現変動の調節機序の解析を進める。その際、適当な分子生物学的手法を用いると共に、①サイトカイン刺激に対して細胞内シグナルに特異的な阻害薬や活性化薬の処理を組み合わせる、②解析モデルに選定した複数の薬物動態関連因子のプロモーター領域内においてサイトカイン応答性を有する配列と作用する転写因子の異同を比較する、等の検討を取り入れる。また、サイトカインに応答した翻訳後修飾を介する転写因子の機能調節の解析には、①分解、②細胞内局在、③他の転写関連因子との相互作用、等の検討を進める。さらに、今後の展開の広がりを期待する為に、他のヒト由来の肝癌細胞株及び大腸癌細胞株における各種薬物動態関連因子及び転写因子群のサイトカイン応答性の検討、また、それらの解析系としての利用可能性の検討を引き続き進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、薬物動態関連因子の発現変動機序のHepaRG細胞を用いたインビトロ解析モデルの検討と選定に重点を置き、計画に沿って研究を進めた。当初計画していたsiRNA遺伝子ノックダウン法を用いた解析から適当な細胞培養条件及び処理条件を検討・工夫した解析の実施に変更したこと、ヒト初代肝細胞を用いた解析項目に対して肝癌細胞株及び大腸癌細胞株を用いた解析を優先して実施したことにより、予定額と実支出額に差異が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成29年度は、本研究課題の目的達成に向けて、研究計画及び推進方策に沿いながら、平成29年度請求額を含め研究費を研究遂行に使用する予定である。その内訳としては、細胞実験関連費、定量的逆転写PCR関連試薬、レポーター解析関連試薬、及び抗体関連試薬の購入を中心に、また、得られた本研究の成果を学会及び学術雑誌において発表する為に使用する予定である。
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