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2016 年度 実施状況報告書

BMP・Wntシグナルネットワークによる全前脳胞症(HPE)発症機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K08444
研究機関広島大学

研究代表者

竹林 公子 (鈴木)  広島大学, 両生類研究センター, 研究員 (00397910)

研究分担者 鈴木 厚  広島大学, 両生類研究センター, 准教授 (20314726)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード神経誘導 / 頭部形成
研究実績の概要

全前脳胞症(holoprosencephaly; HPE)は前脳と顔面正中部の形態形成が異常になる先天性奇形である。遺伝的原因として幾つかの染色体遺伝子座が明らかになりつつあるが、その発症機序はよく分かっていない。研究代表者は独自のスクリーニング法により、BMPシグナルを抑制して神経を誘導する因子としてジンクフィンガータンパク質Bizを単離し、BizがWntシグナルを促進して後方神経を形成することを見出した。興味深いことに、Bizと、その結合因子 (Biz associated protein, Bap) は、全前脳胞症の原因遺伝子座に位置する。本研究は、神経形成におけるBizとBiz結合因子(Bap)の機能的な相互作用、およびBMP・Wntシグナルネットワークに対する作用機序を解析し、全前脳胞症(HPE)発症機構の解明を目的としている。
今年度は、全長型とC末欠損型のBiz、およびBapをコードするmRNAを、単独および複数組み合わせてツメガエル胚に顕微注入する過剰発現実験により、BizとBapの機能的な相互作用を調べる実験をおこなった。神経誘導や頭部形成に対する影響は、背腹軸および前後軸マーカー遺伝子の発現について、アニマルキャップ(未分化、かつ多分化能を持つ外胚葉組織片)を用いた定量的RT-PCRや、WISH法で調べることにより解析した。その結果、BizとBapの両者を組み合わせた場合、神経マーカーsox2や後方神経マーカーhoxb9の発現が強く誘導されることがわかった。また、全前脳胞症(HPE)の原因遺伝子と考えられている遺伝子群(shh, zic2, six3等)についてもBizとBapを共発現したときの影響を調べており、興味深い結果を得ている。したがって、BizとBiz結合因子(Bap)が協調して神経形成に関与していることが強く示唆された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究代表者は、神経形成におけるBizとBiz結合因子 (Biz associated protein, Bap)の機能的な相互作用、およびBMP・Wntシグナルネットワークに対する作用機序を解析し、全前脳胞症(HPE)発症機構の解明につなげることを目的としている。
今年度は、全長型とC末欠損型のBiz、およびBapをコードするmRNAを、単独および複数組み合わせた条件でツメガエル胚に顕微注入する過剰発現実験をおこなった。神経誘導や頭部形成に対する影響は、背腹軸および前後軸マーカー遺伝子の発現について、アニマルキャップ(未分化、かつ多分化能を持つ外胚葉組織片)を用いた定量的RT-PCRや、WISH法で調べることにより解析した。その結果、BizとBapをそれぞれ単独で発現させた場合よりも、両者を組み合わせた場合に、神経マーカーsox2や、後方神経マーカーhoxb9の発現が、より強く誘導されることがわかった。また、全前脳胞症(HPE)の原因遺伝子と考えられている遺伝子群(shh, zic2, six3等)についてもBizとBapの過剰発現の影響を調べており、興味深い結果を得ている。したがって、BizとBapが協調して神経形成に関与していることが強く示唆された。申請当時は平成29・30年の計画としていた実験の中には、既に開始しているものもあり、おおむね研究は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

神経形成におけるBizとBiz結合因子(Bap)およびBMP・Wnt各シグナル調節因子の協調作用を解析するために、全長型とC末欠損型のBiz、Bap、そしてBMP、およびWntシグナルの調節因子群をコードするmRNA、あるいは、それぞれに対するアンチセンスモルフォリノオリゴをツメガエル胚に顕微注入し、過剰発現実験や機能阻害実験を各遺伝子単独および複数を組み合わせた条件で行う。アフリカツメガエルBapの機能を阻害するために、LとS両方の染色体由来の遺伝子を同時に確実に翻訳阻害することが期待できるモルフォリノオリゴを作製する。そのため、アフリカツメガエルL、S各染色体由来の遺伝子を単離し、塩基配列を確認する。神経誘導や頭部形成に対する影響は、背腹軸および前後軸マーカー遺伝子の発現について、アニマルキャップを用いた定量的RT-PCRや、WISH法で解析することによって調べる。また、全前脳胞症(HPE)の原因遺伝子と考えられている遺伝子群についても、その遺伝子発現への影響を調べる。
さらに、エピトープタグを付加したBapを作成し、既に作成済みのBizやBMP・Wntシグナル調節因子群を様々な組み合わせで培養細胞に発現させた後、共免疫沈降法を用いて各タンパク質間の結合を解析する。また、発現量と構成因子の組み合わせを変化させて、構成因子間の結合様式(競合と相乗効果)を解析する。さらに、各タンパク質のドメイン欠失変異体を用いて各構成因子間の結合に必要な機能ドメインを同定し、BizとBapが各BMP・Wntシグナル調節因子を制御する作用機序を生化学的に明確にする。

次年度使用額が生じた理由

アンチセンスモルフォリノオリゴを作製を予定していたが、塩基配列確認のため、アフリカツメガエルLとS両方の染色体由来の遺伝子を単離することに時間を要した。また、消耗品の購入に関して、各社サンプルの比較検討が必要だったため、年度内の購入に間に合わなかった。

次年度使用額の使用計画

アフリカツメガエルBapの機能を阻害するために、LとS両方の染色体由来の遺伝子を同時に確実に翻訳阻害することが期待できるモルフォリノオリゴを作製する。そのため、アフリカツメガエルL、S各染色体由来の遺伝子を単離し、塩基配列を確認する。神経誘導や頭部形成に対する影響は、背腹軸および前後軸マーカー遺伝子の発現について、アニマルキャップを用いた定量的RT-PCRや、WISH法で解析することによって調べる。また、全前脳胞症(HPE)の原因遺伝子と考えられている遺伝子群についても、その遺伝子発現への影響を調べる。および、消耗品購入を予定している。

  • 研究成果

    (19件)

すべて 2017 2016 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 3件、 査読あり 5件、 謝辞記載あり 5件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 3件、 招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] Univ. of Texas/Univ. of California/HudsonAlpha Genome Sequencing Center(米国)

    • 国名
      米国
    • 外国機関名
      Univ. of Texas/Univ. of California/HudsonAlpha Genome Sequencing Center
    • 他の機関数
      1
  • [国際共同研究] Brawijaya University(インドネシア)

    • 国名
      インドネシア
    • 外国機関名
      Brawijaya University
  • [雑誌論文] Genomic organization and modulation of gene expression of the TGF-beta and FGF pathways in the allotetraploid frog Xenopus laevis.2017

    • 著者名/発表者名
      Suzuki, A., Yoshida, H., van Heeringen, S.J., Takebayashi-Suzuki, K., Veenstra, G.J.C. and Taira, M.
    • 雑誌名

      Developmental Biology

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Genome organization of the vg1 and nodal3 gene clusters in the allotetraploid frog Xenopus laevis.2017

    • 著者名/発表者名
      Suzuki, A., Uno, Y., Takahashi, S., Grimwood, J., Schmutz, J., Mawaribuchi, S., Yoshida, H., Takebayashi-Suzuki, K., Ito, M., Matsuda, Y., Rokhsar, D., and Taira, M.
    • 雑誌名

      Developmental Biology

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Identification and comparative analyses of Siamois cluster genes in the Xenopus laevis and tropicalis.2017

    • 著者名/発表者名
      Haramoto, Y., Saijyo, T., Tanaka, T., Furuno, N., Suzuki, A., Ito, Y., Kondo, M., Taira, M., and Takahashi, S.
    • 雑誌名

      Developmental Biology

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Involvement of JunB proto-oncogene in tail formation during early Xenopus embryogenesis.2016

    • 著者名/発表者名
      Yoshida, H., Okada M., Takebayashi-Suzuki, K., Ueno, N., and Suzuki, A.
    • 雑誌名

      Zoological Science

      巻: 33 ページ: 282-289

    • DOI

      http://dx.doi.org/10.2108/zs150136

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.2016

    • 著者名/発表者名
      Session, A.M., Uno, Y., Kwon, T., Chapman, J., Toyoda, A., Takahashi, S., Fukui, A., Hikosaka, A, Suzuki, A., Kondo, M. et al.
    • 雑誌名

      Nature

      巻: 538 ページ: 336-343

    • DOI

      10.1038/nature19840

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Coordinated regulation of the dorsal-ventral and anterior-posterior patterning of Xenopus embryos by the zinc finger protein Biz2017

    • 著者名/発表者名
      竹林公子、鈴木 厚
    • 学会等名
      日本動物学会中国四国支部 広島県例会
    • 発表場所
      広島県東広島市広島大学
    • 年月日
      2017-03-09 – 2017-03-09
  • [学会発表] Analysis of the function of bap gene during Xenopus body axis formation2017

    • 著者名/発表者名
      内田実沙、竹林公子、吉田和史、鈴木 厚
    • 学会等名
      日本動物学会中国四国支部 広島県例会
    • 発表場所
      広島県東広島市広島大学
    • 年月日
      2017-03-09 – 2017-03-09
  • [学会発表] Neural specific kinase promotes early neural formation in Xenopus embryos2017

    • 著者名/発表者名
      Regina Putri Virgirinia, Nusrat Jahan, Maya Okada, Kimiko Takebayashi-Suzuki, Hitoshi Yoshida, Hajime Akao, Fatchiyah Fatchiyah, Naoto Ueno, Atsushi Suzuki
    • 学会等名
      日本動物学会中国四国支部 広島県例会
    • 発表場所
      広島県東広島市広島大学
    • 年月日
      2017-03-09 – 2017-03-09
  • [学会発表] Analysis of the AP-1 family during tail formation and regeneration2017

    • 著者名/発表者名
      中村誠、吉田和史、竹林公子、鈴木 厚
    • 学会等名
      日本動物学会中国四国支部 広島県例会
    • 発表場所
      広島県東広島市広島大学
    • 年月日
      2017-03-09 – 2017-03-09
  • [学会発表] Neural specific kinase promotes early neural formation in Xenopus embryos2016

    • 著者名/発表者名
      Regina Putri Virgirinia, Nusrat Jahan, Maya Okada, Kimiko Takebayashi-Suzuki, Hitoshi Yoshida, Hajime Akao, Fatchiyah Fatchiyah, Naoto Ueno and Atsushi Suzuki.
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市パシフィコ横浜
    • 年月日
      2016-11-30 – 2016-12-02
  • [学会発表] 尾芽幹細胞領域の形成と脊髄の再生におけるJunBの機能解析2016

    • 著者名/発表者名
      吉田和史、岡田麻耶、中村 誠、竹林公子、上野直人、鈴木 厚
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市パシフィコ横浜
    • 年月日
      2016-11-30 – 2016-12-02
  • [学会発表] NBRP「ネッタイツメガエル」:生物医学研究の発展に役立つモデル動物ネッタイツメガエル2016

    • 著者名/発表者名
      柏木昭彦, 柏木啓子, 花田秀樹, 鈴木 厚, 竹林公子, 古野伸明, 田澤一朗, 倉林 敦, 中島圭介, 鈴木賢一, 山本 卓
    • 学会等名
      第39回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      神奈川県横浜市パシフィコ横浜
    • 年月日
      2016-11-30 – 2016-12-02
  • [学会発表] Xenopus resource centers - a network to support researchers2016

    • 著者名/発表者名
      Boujard, M., Guille, M., Horb, M., Robert, J., and Suzuki, A
    • 学会等名
      16th International Xenopus Conference
    • 発表場所
      ギリシャ、クレタ島
    • 年月日
      2016-08-28 – 2016-09-01
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] A role of JunB proto-oncogene in tailbud induction and tail regeneration during early Xenopus embryogenesis2016

    • 著者名/発表者名
      Yoshida, H., Okada M., Takebayashi-Suzuki, K., Ueno, N., and Suzuki, A.
    • 学会等名
      16th International Xenopus Conference
    • 発表場所
      ギリシャ、クレタ島
    • 年月日
      2016-08-28 – 2016-09-01
    • 国際学会
  • [学会発表] National BioResource Project (NBRP) for Xenopus: recent developments at the Asian hub for the international Xenopus research community2016

    • 著者名/発表者名
      Atsushi Suzuki, Keiko Kashiwagi, Hideki Hanada, Nobuaki Furuno, Ichiro Tazawa, Atsushi Kurabayashi, Keisuke Nakajima, Kimiko Takebayashi-Suzuki, Takeshi Igawa, Masayuki Sumida, Hitoshi Yoshida, Shigeru Murakami, Kunihiko Oriha, Takako Mido, Mitsuru Masumoto, Kanako Kawaguchi, Akari Miura, and Akihiko Kashiwagi.
    • 学会等名
      16th International Xenopus Conference
    • 発表場所
      ギリシャ、クレタ島
    • 年月日
      2016-08-28 – 2016-09-01
    • 国際学会
  • [学会発表] ゲノム・遺伝子から見た発生の仕組みとナショナルバイオリソースプロジェクト・ネッタイツメガエル2016

    • 著者名/発表者名
      鈴木 厚
    • 学会等名
      「理科おもしろ実験教室」
    • 発表場所
      兵庫県赤穂市赤穂市立有年中学校
    • 年月日
      2016-08-09 – 2016-08-09
    • 招待講演
  • [備考] 研究活動及び研究成果報告書 PDF 版の公開

    • URL

      http://home.hiroshima-u.ac.jp/amphibia/main/InstAmphBiol/yan_jiuto_jiao_yu.html

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公開日: 2018-01-16  

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