| 研究課題/領域番号 |
16K08471
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
菱川 善隆 宮崎大学, 医学部, 教授 (60304276)
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| 研究分担者 |
石塚 匠 宮崎大学, 医学部, 研究員 (50700085)
川口 真紀子 宮崎大学, 医学部, 助教 (90405598)
チョウジョウフ ナランツオツク 宮崎大学, 医学部, 助教 (90640962)
ピュー シンウー 宮崎大学, 医学部, 助教 (90718123)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 蛍光共鳴エネルギー移動 / in situ hybidization / 28S rRNA / microRNA / miR-122 / ラット肝切除モデル / パラフィン切片 / 凍結切片 |
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| 研究実績の概要 |
高感度蛍光発色（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET；蛍光共鳴エネルギー移動）を利用して、組織切片上で特定の細胞での小分子非翻訳RNAであるmicroRNA (miRNA)発現動態を解析する新たな検出法として、FRET based in situ ハイブリダイゼーション(FRET-ISH)法を開発し、組織・細胞レベルでのmiRNA局在検出法を確立することを目的とする。今回は、我々が通常のISHにおいて陽性コントロ ルとして用いている28S rRNA配列を基にしたmiRNA用ハイブリダイゼーション条件の最適化を行った。具体的には標的とするmiRNA自体の配列が25塩基以下と非常に短いことより、大量に組織内に発現し、通常のISH陽性コントロール として用いている28ＳrRNA検出プローブ（39塩基数）から22塩基数の短いプローブ配列を選択して、2種類のFRET標識プローブを作製し、ラット肝臓パラフィン及び凍結切片を用いて①プローブ濃度、②ハイブリダイゼーション温度、③ハイブリダイゼーション溶液組成、④ハイブリダイゼーション反応時間と洗浄条件、を中心に検討して小分子RNA検出のためのFRET-ISH法の最適な条件検討を行った。その結果、通常のISH法では、ハイブリダイゼーションの反応時間は17時間程度必要であるのに対し、FRETでのハイブリダイゼーション反応時間はわずか3時間で28S rRNAの検出に成功した。現在、肝臓をはじめ様々な組織・細胞で豊富に存在するmiR-122に対するFRET-miR-122プローブを作製し、ハイブリダイゼーションに関する諸条件の最適化を図り、組織内での特定のmiRNA検出に関して検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
高感度蛍光発色（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET；蛍光共鳴エネルギー移動）標識した通常より短い28S rRNA検出 プローブを用いてFRET-ISH法の条件を検討し、組織内での特定のｍRNAの検出に成功した。現在、microRNA-122 (miR-122)検出用プローブの作製を行い、ラット肝切除モデルでの肝臓パラフィン切片ならびに凍結切片を用いてmiR-122の発現動態を解析中であり、研究計画はおおむね 順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでのFRET-ISH法用の諸条件を基にして、miR-122の組織内発現動態をラット正常肝臓組織で明らかにするとともに、がん化など多様な生命現象に関与するmicroRNAの内、肝組織で高発現することが知られているmiR-21に対するFRET-miR-21プローブを作製し、ラット70 ％肝切除モデルを作製し、肝再生過程でのmiR-21の発現動態についてFRET-ISHで経時的に検討するとともに、増殖活性（PCNA）、IL-6 、増殖因子（HGF、KGF）との関連について免疫組織化学で検討する。また、肝切除で残った左葉にエレクトロポレーションによりラットmiR-122並びにmiR-21に対するlocked nucleic acid (LNA) miRNAインヒビターを導入してmiRNA発現抑制実験を行い、miRNA制御による人為的な細胞制御の可能性を検討する。
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