| 研究課題/領域番号 |
16K08471
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
菱川 善隆 宮崎大学, 医学部, 教授 (60304276)
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| 研究分担者 |
石塚 匠 宮崎大学, 医学部, 助教 (50700085)
川口 真紀子 宮崎大学, 医学部, 助教 (90405598)
チョウジョウフ ナランツオツク 宮崎大学, 医学部, 講師 (90640962)
ピュー シンウー 宮崎大学, 医学部, 助教 (90718123) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 蛍光共鳴エネルギー移動 / in situ hybridization / 28S rRNA / microRNA / miR122 / ラット肝切除モデル / パラフィン切片 / 凍結切片 |
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| 研究実績の概要 |
高感度蛍光発色（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET；蛍光共鳴エネルギー移動）を利用して、組織切片上で特定の細胞での小分子非翻訳RNAであるmicroRNA (miRNA)発現動態を解析する新たな検出法として、FRET based in situハイブリダイゼーション(FRET-ISH)法による、組織・細胞レベルでの新たなmiRNA 局在検出法を開発することを目的とした。標的とするmiRNA自体が25塩基以下と非常に短いことより、まずmiRNA用プローブのハイブリダイゼーション条件の最適化を行った。具体的には、大量に組織内に発現している28S rRNAについて、通常ISH陽性コントロールに使う28ＳrRNA検出プローブ配列（39塩基数）から、miRNAの塩基数に対応した22塩基数の短いプローブ配列を選択し、蛍光色素を標識したFRET標識プローブを作製し、ラット肝臓パラフィン及び凍結切片を用いて①プローブ濃度、②ハイブリダイゼーション温度、③ハイブリダイゼーション溶液組成、④ハイブリダイゼーション反応時間と洗浄条件、を検討して小分子RNA検出のためのFRET-ISH法の最適な条件検討を行った。その結果、通常のISH法と比較して、プローブ濃度は１/10に、ハイブリダイゼーション反応時間は3時間（通常17時間）で検出可能であった。この条件を基に、肝臓に豊富に存在するmiR-122のFRETプローブを作製しマウス肝組織内発現を検討した。その結果、miR-122は、正常肝組織内の中心静脈周囲の肝細胞での発現が強く認められ、miRNA発現が組織内の部位により異なっている可能性があることが判明した。本研究で、FRET-ISH法が組織細胞内でのmiRNAの発現局在の検出に関する新たな解析法として有用であることを明らかにした。
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