細胞表面抗原を利用した下垂体前葉組織幹細胞の同定と単離、その分化誘導の探索

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08475
• 研究機関: 杏林大学
• 研究代表者: 堀口 幸太郎 杏林大学, 保健学部, 講師 (10409477)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 下垂体前葉 / S100βタンパク質陽性細胞 / 濾胞星状細胞 / 組織幹細胞 / 細胞表面抗原 / CD24

研究実績の概要

組織幹細胞はある程度の多分化能を持ち、発生過程や細胞死、損傷組織の再生において、新しい細胞を供給する役割を持つと考えられている。下垂体前葉は、ホルモンの合成・分泌を行い、成長、生殖、代謝、行動など多くの生体機能の制御に関与している重要な内分泌器官である。5種類のホルモン産生細胞と、非ホルモン産生細胞であるS100βタンパク質陽性細胞（S100β陽性細胞）と、血管系の細胞から構成される。申請者は、ラット下垂体前葉内S100β陽性細胞は幹細胞マーカーであるCXCR4を発現することを報告している。本研究では、１）CXCR4陽性を示すS100β陽性細胞が細胞表面抗原であるCD24を発現することを組織学的手法及び分子生物学的手法により同定した。そして、CD24抗体とpluriBead® Cell Separation kitを使うことで簡単にラット下垂体前葉からCD24/S100β陽性細胞を単離することに成功した。そして単離した細胞がSOX2など種々の幹細胞マーカーの高い発現を示した。この結果は学会にて発表し、現在論文執筆中である。２）S100β陽性細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックラットの胎生期下垂体を観察することで、S100β陽性細胞の一部が下垂体前葉外から血管形成と共に下垂体前葉に侵入して定着するという新たなS100β陽性細胞の起源を明らかにし、論文掲載された。
３）膜タンパク質であるCD90が下垂体前葉においてThyrotropeで発現することを明らかにし、さらにpluriBead Cell Separation kitと抗体を使用することで簡単にThyrotropeを純化・培養できることを明らかにし、論文掲載された。
現在単離したCD24/CXCR4発現細胞の分化誘導をin vitroの系で行っている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

組織幹細胞はある程度の多分化能を持ち、発生過程や細胞死、損傷組織の再生において、新しい細胞を供給する役割を持つと考えられている。下垂体前葉は、5種類のホルモン産生細胞と、非ホルモン産生細胞であるS100βタンパク質陽性細胞（S100β陽性細胞）と、血管系の細胞から構成される。S100β陽性細胞はheterogeneityが高く、その中のサブポピュレーションが下垂体前葉組織幹細胞の可能性が示唆されてきた。申請者は、ホルモン産生細胞の1つであるThyrotropeの細胞純化・培養に成功した。そして幹細胞性のS100β陽性細胞の単離を膜タンパク質の発現とその抗体、市販のキットを使用し成功した。さらにその単離した細胞が種々の幹細胞マーカーを発現することを明らかにした。そして単離した細胞は血管網様構造を形成すること、そのシグナル伝達を既に明らかにしている（未発表）。既に2報の投稿論文が掲載されており、研究業績から鑑みても当初の計画通りに進展していると判断できる。

今後の研究の推進方策

平成28年度に引き続いた解析を行う。特に幹細胞性S100β陽性細胞の血管網様構造への分化過程とその制御機構のさらなる詳細な解明を目指し、これまで蓄積されてきたマイクロアレイの解析結果を基に、発現遺伝子の発現解析、それらの組織学的観察、最終的に高確率の分化誘導を成功させる。また当初単離したCD9/CXCR4発現細胞の単離からホルモン産生細胞への分化誘導に挑戦する。具体的には、ラット下垂体前葉細胞をコラーゲン処理によりバラバラにしたのち、CD9抗体とpluriBeads kitを用いてCD9発現細胞を単離し、3次元培養（ハンギングドロップ）によって培養する。そこに多種の成長因子などを投与し、ホルモン産生細胞への分化を組織学的に観察する。さらに遺伝子発現、ホルモン分泌を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Expression and localization of forkhead 1 box protein FOXJ1 in S100β-positive multiciliated cells of the rat pituitary. (2017)
  • 著者名/発表者名: Nakakura T, Suzuki T, Horiguchi K, Fujiwara K, Tsukada T, Asano-Hoshino A, Tanaka H, Arisawa K, Nishijima Y, Nekooki-Machida Y, Kiuchi Y, Hagiwara H
  • 雑誌名: Medical molecul. Morphol. 巻: 50 ページ: 59-67
  • DOI: 10.1007/s00795-016-0148-1.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of THY1 as a novel thyrotrope marker and THY1 antibody-mediated thyrotrope isolation in the rat anterior pituitary gland. (2016)
  • 著者名/発表者名: Horiguchi K, Nakakura T, Yoshida S, Tsukada T, Kanno N Hasegawa R, Takigami S, Ohsako S, Kato T, Kato Y
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 480 ページ: 273-279
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.10.049
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Fibromodulin Expression in Folliculostellate Cells and Pericytes Is Promoted by TGFβ Signaling in Rat Anterior Pituitary Gland. (2016)
  • 著者名/発表者名: Syaidah R, Tsukada T, Azuma M, Horiguchi K, Fujiwara K, Kikuchi M, Yashiro T
  • 雑誌名: Acta. Histochem. Cytochem. 巻: 49 ページ: 171-179
  • DOI: 10.1267/ahc.16021
  • 査読あり
• [雑誌論文] S100b-positive cells of mesenchymal origin reside in the anterior lobe of the embryonic pituitary gland. (2016)
  • 著者名/発表者名: Horiguchi K¶, Yako H¶, Yoshida S, Fujiwara K, Tsukada T, Kanno N, Ueharu H, Nishihara H, Kato T, Yashiro T, Kato Y, ¶These authors contributed equally to this work.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: - ページ: e0163981
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0163981
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshida S, Nishimura N, Ueharu H, Nishihara H, Kanno N, Higuchi M, Horiguchi K, Kato T, Kato Y
  • 雑誌名: Stem Cell Res. 巻: 17 ページ: 318-329
  • DOI: 10.1016/j.scr.2016.08.016
  • 査読あり
• [雑誌論文] Folliculostellate cell interacts with pericyte via TGFbeta2 in rat anterior pituitary. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tsukada T, Azuma M, Horiguchi K, Fujiwara K, Kouki T, Kikuchi M, Yashiro T
  • 雑誌名: J. Endoclinol. 巻: 229 ページ: 159-170
  • DOI: 10.1530/JOE-16-0033
  • 査読あり
• [雑誌論文] CXCL10/CXCR3 signaling mediates inhibitory action by Interferon-Gamma on CRF-stimulated adrenocorticotropic hormone (ACTH) release. (2016)
  • 著者名/発表者名: Horiguchi K, Fujiwara K, Tsukada T, Yoshida S, Higuchi M, Tateno K, Hasegawa R, Takigami S, Ohsako S, Yashiro T, Kato T, Kato Y
  • 雑誌名: Cell Tissue Res. 巻: 364 ページ: 395-404
  • DOI: 10.1007/s00441-015-2317-2
  • 査読あり
• [学会発表] 下垂体前葉内濾胞星状細胞が発現するCD抗原の探索． (2017)
  • 著者名/発表者名: 堀口幸太郎、吉田彩舟、藤原研、塚田岳大、加藤たか子、長谷川瑠美、瀧上 周、大迫俊二、屋代 隆、加藤幸雄
  • 学会等名: 第122回日本解剖学会学術総会
  • 発表場所: 長崎大学医学部
  • 年月日: 2017-03-29
• [学会発表] 下垂体前葉内濾胞星状細胞で発現するケモカインCXCL10の機能解析． (2016)
  • 著者名/発表者名: 堀口幸太郎、長谷川瑠美、瀧上 周、大迫俊二
  • 学会等名: 第45回杏林医学会総会
  • 発表場所: 杏林大学医学部
  • 年月日: 2016-11-19
• [学会発表] ラット下垂体前葉内TSH産生細胞における細胞表面抗原CD90の発現． (2016)
  • 著者名/発表者名: 堀口幸太郎，中倉敬，吉田彩舟，長谷川瑠美，瀧上周，大迫俊二，加藤たか子，加藤幸雄
  • 学会等名: 第109回日本繁殖生物学会
  • 発表場所: 麻布大学農学部
  • 年月日: 2016-09-12
• [学会発表] ラット下垂体前葉におけるケモカインおよびケモカインレセプターの発現解析． (2016)
  • 著者名/発表者名: 堀口幸太郎、長谷川瑠美、瀧上 周、大迫俊二
  • 学会等名: 第57回日本組織細胞化学会総会学術集会
  • 発表場所: 杏林大学保健学部
  • 年月日: 2016-09-03
• [学会発表] 細胞表面抗原CD90を利用したラット下垂体前葉からのTSH産生細胞の単離． (2016)
  • 著者名/発表者名: 堀口幸太郎、吉田彩舟、菅野尚子、上春浩貴、陳默、長谷川瑠美、加藤たか子、瀧上 周、大迫俊二、加藤幸雄
  • 学会等名: 第89回日本内分泌学会学術総会
  • 発表場所: 京都市
  • 年月日: 2016-04-21
• [備考] 杏林大学保健学部教員紹介
  • URL: http://www.kyorin-u.ac.jp/univ/faculty/health/staff/detail.php?id=hea40212