| 研究課題/領域番号 |
16K08478
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| 研究機関 | 名城大学 |
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研究代表者 |
湯川 和典 名城大学, 薬学部, 教授 (20301434)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 脳梁 / 軸索ガイダンス / プレキシンA1 / セマフォリン / パイオニア軸索 / 正中線交差 / 正中線道標 |
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| 研究実績の概要 |
神経軸索の伸長を導くセマフォリンの受容体PlexinA1を欠損するBALB/c系統マウスでは、脳梁欠損が高頻度（生後0.5日齢で100%）に生じる。脳梁発達におけるPlexinA1の機能探索のため、胎生16.5日齢（E16.5）及びE17.5の野生型(WT)とPlexinA1欠損マウス脳組織におけるPlexinA1、ニューロピリン1（Npn1）、セマフォリンのSema3A及びSema3Cとカルレチニン(CR)の局在を免疫組織化学にて解析した。その結果、E16.5とE17.5の脳梁背側部のDCC陽性パイオニア軸索におけるPlexinA1の局在が判明した。Sema3A は、E16.5の大脳外側部を中心に局在し、E17.5では正中線に強発現部位を認めた。Sema3Cは、正中線道標内のCR陽性細胞に局在が確認された。 Npn1は脳梁背側部に局在し、正中線でのNpn1とPlexinA1の分子間会合が共免疫沈降法により判明した。
脳梁軸索の正中線交差におけるPlexinA1の役割解析のため、Npn1の免疫組織化学とDiIを用いて脳梁軸索の伸長を追跡する実験を行った。両方法の結果より、E17.5のPlexinA1欠損脳梁軸索が正中線を交差する頻度はWTと比較して有意に低いことが判明した。Sema3Aの脳梁軸索伸長反発活性とSema3Cの脳梁軸索伸長誘引活性を伝える受容体としてPlexinA1が作用するかどうか検討するため、WTとPlexinA1欠損帯状回外移植片を用いて軸索ガイダンスアッセイを行った。その結果、Sema3Aの軸索反発活性とSema3Cの軸索誘引活性の両方が、WTと比較してPlexinA1欠損帯状回外移植片で有意に減弱することが判明した。そのため、Sema3A 及びSema3C とPlexinA1との相互作用が脳梁パイオニア軸索の正中線交差に重要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1, 脳梁発達におけるセマフォリンと受容体の局在マップ作り
(1) E16.5とE17.5の大脳正中線領域のCR陽性細胞におけるSema3Cの局在が判明した。Sema3Aは、E16.5では大脳外側部に局在し、脳梁軸索が正中線交差を始めるE17.5では正中線で発現が増強した。(2) E16.5とE17.5のDCC陽性パイオニア軸索におけるPlexinA1受容体の局在が判明した。さらにE15.5の正中線領域におけるPlexinA1受容体とニューロピリン1（Npn1）の分子間会合が明らかになった。
2, パイオニア軸索の伸長方向の追跡
(1)免疫組織化学とdiI注入によるパイオニア軸索路の追跡： Npn1の免疫組織化学でE17.5の脳梁軸索の伸長を解析した結果、野生型(WT)では14匹中11匹が正中線を交差した。E17.5のPlexinA1欠損マウスでは、14匹中2匹のみにおいて脳梁軸索が正中線を交差した。さらに、diIによるパイオニア軸索の伸長追跡の結果、E17.5のPlexinA1欠損パイオニア軸索が正中線を越える頻度は、WTと比較して有意に低いことが判明した（WT:10匹中9匹、PlexinA1欠損：16匹中2匹が正中線交差）。(2)帯状回外移植片の軸索伸長に及ぼすSema3C作用の解析：Sema3CのPlexinA1依存性軸索伸長作用証明のため、各セマフォリン分泌性細胞株を作製し、E15.5のWTとPlexinA1欠損帯状回外移植片との共培養を行い軸索伸長の解析を行った。Sema3Cの軸索誘引活性とSema3Aの反発活性の両方が、PlexinA1欠損帯状回外移植片で減弱することが判明した。
3, 正中線道標形成におけるPlexinA1の役割の検討は、GAD67-GFPマウスのBALB/cマウス系統への戻し交配が不十分であり、平成30年度に解析を実行する。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 平成29年度の課題：脳梁発達におけるセマフォリンと受容体の局在マップ作製は、PlexinA1受容体、セマフォリンと結合してPlexinA1と会合するニューロピリン１(Npn1)、セマフォリンのSema3AとSema3Cについての局在マップは完成された。しかし、PlexinA1に直接的に結合し化学反発作用を示すSema6DとSlit2の局在を明らかにし脳梁軸索の正中線交差におけるPlexinA1の役割を解明する必要がある。そして、Sema6DとSlit2カルボキシル末端ペプチド(Slit2c)のPlexinA1依存性軸索伸長作用の検討のため、帯状回外移植片の軸索伸長に及ぼすSema6DとSlit2c作用の解析を続ける。
2. 正中線道標形成におけるPlexinA1の役割：正中線道標の異常発達の有無検討のため、E16.5及びE17.5の野生型(WT)とPlexinA1欠損脳をグリア線維性タンパクやカルレチニン等の抗体で免疫組織化学を行い、各抗体陽性グリアおよびニューロン数を比較する解析を続ける。次に、PlexinA1欠損脳の脳梁形成予定領域におけるGABA陽性介在ニューロンの減少の有無検討のため、GAD67-GFP:PlexinA1欠損マウスとGAD67-GFP:WTマウス間でGFP陽性細胞数の比較を行う。さらに、道標形成不全の脳梁欠損への寄与解明のため、WTとPlexinA1欠損脳スライス培養間で帯状回の交換移植を行い、各スライス培養において正中線を越えず異常投射する軸索の割合を比較する。
3. PlexinA1欠損マウスの自発運動亢進、プレパルス抑制減弱等の行動異常と脳梁欠損との関連：各行動異常と脳梁欠損との関連解明のため、行動解析後の成体マウスの脳組織を解析し脳梁の有無を確認する実験を続ける。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度に、当初の見積額より実際の購入額が安価に済んだ物品があり残高が発生し、次年度使用額が発生しました。平成30年度分として請求した助成金に、この次年度使用額を合わせて研究計画の遂行に必要な物品の購入に有効に活用していく所存であります。
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