| 研究課題/領域番号 |
16K08481
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
早坂 晴子 近畿大学, 理工学部, 准教授 (70379246)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 血管内皮細胞 / メラノーマ |
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| 研究実績の概要 |
高内皮細静脈 (high endothelial venules : HEV) は血中からリンパ球をリンパ節へ誘導する機能をもち、リンパ節やパイエル板に限局して形成される特殊な血管である。最近の研究では、腫瘍や動脈硬化病変周囲の組織においても、HEV 内皮細胞に選択的に発現するケモカイン CCL21a や末梢リンパ節アドレッシン (PNAd) 陽性の血管 (HEV様血管:HEV-LV) が形成されることが明らかになっている。しかし HEV-LV が腫瘍形成に関与するのか、リンパ節 HEVと同様の遺伝子発現パターンと機能を持つのかなど多くの点が不明である。本年度は、腫瘍組織の HEV-LV 形成を観察し、HEV-LV内皮細胞を分離するため、Ccl21a プロモーター 制御下で赤色蛍光タンパク質 tdTomato を発現するノックインマウスをレポーターとして利用する可能性を検証した。レポーターマウス皮下に、悪性黒色腫メラノーマ細胞 B16F10、あるいは異種タンパク質としてヒトCCR7タンパク質を発現する B16F10を移植し、形成されたメラノーマ組織における CCL21a 陽性 HEV-LV の検出を試みた。免疫組織染色では、どちらの細胞株においてもtCCL21もPNAdの発現も極めて低いレベルであり、検出が困難であった。一方レポーター マウスでは、腫瘍組織内にtdTomato 陽性、CD34 陽性の管腔構造が観察された。このことから、レポーターマウスのtdTomato を指標に HEV-LV の観察と解析が可能であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は予備実験を中心に実験をおこなった。二次リンパ組織でのHEVのライブイメージングが将来的な目標であるため、CCL21のプロモーター制御下でtdTomatoを発現するCCL21a-tdTomatoマウスに癌細胞を移植した。CCL21はHEVに発現するケモカインであり、これまでの報告から、癌組織内HEV-LVにおいても発現が報告されている。遺伝子組換えマウスおよび野生型マウスの皮下あるいは腹腔内に癌細胞を移植し腫瘍を形成させ、癌組織内HEV-LV形成の観察をおこなったところ、CCL21a-tdTomatoホモおよびヘテロマウスにHEV-LVとみられる腫瘍内血管が観察できた。現在、腫瘍からHEV-LVを構成する細胞を細胞分離し、遺伝子発現解析を行なっているところである。一方、本年度は血管内皮細胞特異的Dach1 欠損マウスおよび過剰発現マウスを担癌マウスとして使用し、Dach1の欠失あるいは発現亢進による癌組織内HEV-LV新生レベルの変化を対照群と比較解析する予定であったが、動物飼育スペースの拡大が困難であったため次年度に持ち越した。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの私たちの研究から、転写調節因子Dach1遺伝子を欠損するリンパ節では、HEV 特異的マーカーである接着分子 PNAd (Peripheral Node Addressin) の発現が著しく減少していた。また恒常的発現プロモーターによりDach1を過剰発現するマウスを作製し免疫組織化学解析を行ったところ、二次リンパ組織でのHEV形成亢進とPNAd発現上昇がみられた。このことから、Dach1がHEV内皮細胞特異的遺伝子発現と機能的HEV形成に関与することが示唆されている。そこで血管内皮細胞特異的Dach1 欠損マウスおよび過剰発現マウスを担癌マウスとして使用し、Dach1の欠失あるいは発現亢進による癌組織内HEV-LV新生レベルの変化を対照群と比較解析する。私たちは昨年度までに血管内皮細胞特異的Dach1欠損マウスを樹立した。またRosa26プロモーターの下流にDach1遺伝子を組込み、Dach1発現が過剰発現する遺伝子組換えマウスを既に作製済みである。これらのマウスを用いて、Dach1過剰発現が癌組織内HEV-LV新生を誘導するかどうかを検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の予定では、Dach1過剰発現マウス、血管内皮細胞特異的Dach1遺伝子欠損マウスのコロニーを拡大する予定であったが、飼育スペースの拡充ができなかったため予定より少数の個体で実験をおこなってきた。このため、遺伝子型解析に用いる消耗品類にかかる費用が予定より少額になった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度は前年度の飼育スペースを約3倍に拡充することが可能になり、十分な個体数のマウスを飼育することができる予定である、このため、遺伝子型解析に用いる消耗品類を購入する。
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