| 研究課題/領域番号 |
16K08496
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
岸 博子 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40359899)
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| 研究分担者 |
張 影 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10711260)
森田 知佳 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70763796)
小林 誠 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80225515)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 血管平滑筋 / 血管異常収縮 / カルパイン / 細胞骨格 / 機能プロテオミクス |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者らは、血管平滑筋異常収縮に特異的なシグナル伝達経路として、SPC/Fyn/ROK経路を、世界で初めて明らかにし、更に、異常収縮新規シグナル分子として、細胞骨格関連分子V1を同定した。V1は、SPC刺激により限定分解を受け、しかも、カルパイン阻害薬は、SPCによる血管平滑筋異常収縮を抑制した事から、本研究では、血管平滑筋異常収縮のシグナル伝達系におけるカルパインの重要性、および、細胞骨格関連分子V1分解断片の、血管平滑筋異常収縮に果たす役割、の2点を解明する事を目的とした。
計画1. カルパインの血管平滑筋異常収縮シグナル伝達への関与の分子生物学的検証では、カルパインの遺伝子発現抑制を行う事を目的に、ヒト冠状動脈平滑筋細胞において、CRISPR/Cas9システムの実験系を構築を試みたが、遺伝子導入効率が低く、遺伝子導入方法を変更したため、進捗がやや遅れている。一方、カルパインの内因性阻害分子であるカルパスタチンを強制発現させる事には成功した。
計画2. 細胞骨格関連分子V1の分解が、血管平滑筋異常収縮に果たす役割の検証では、細胞骨格関連分子V1の、カルパインによる限定分解産物に相当する断片を組換え蛋白質として発現させるためのベクターを構築中である。
計画3. 機能プロテオミクスによる、新規カルパイン基質の探索では、カルパインに結合する蛋白質を免疫沈降するために、ヒト血管平滑筋細胞をSPCで刺激し、細胞抽出液を作成した。
計画4. カルパインの血管平滑筋異常収縮シグナル伝達への関与の生理学的検証では、マウスの微小な血管での張力測定を可能にするために、ミオグラフにマウス血管組織をマウントし、張力測定を行う実験系を構築した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画1では、CRISPR/Cas9系によって、ヒト血管平滑筋細胞でのカルパインの遺伝子発現を欠失させる予定だったが、コントロールベクターの遺伝子導入効率が非常に低かったため、遺伝子導入方法を変更して、現在検討中である。一方、カルパインの内因性阻害分子であるカルパスタチンを強制発現させる事には成功した。他の計画は概ね計画通りに進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画1では、CRISPR/Cas9系コントロールベクターの、高効率での遺伝子導入が確認でき次第、実験用ベクターを導入し、カルパインの遺伝子発現を欠失させたヒト血管平滑筋細胞を作成する。平成28年度に作成したカルパスタチンを強制発現させたヒト血管平滑筋細胞とともに、これらの細胞において、SPCによるFynの活性化やROKの活性化が抑制されるかを、検証する。他の計画は、引き続き計画通りに進める。
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