| 研究課題/領域番号 |
16K08512
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| 研究機関 | 公益財団法人微生物化学研究会 |
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研究代表者 |
立田 大輔 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (20442569)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | p53依存的細胞死 / アフィニティービーズ / キノフラシン結合タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
（平成29年度の成果の具体的内容）p53依存的細胞死を誘導する新規化合物、キノフラシンやコッコキノンの標的や作用機序、キノフラシンのin vivo抗腫瘍効果を明らかにする目的で以下の実験を行った。昨年の結果、キノフラシンのアフィニティービーズを作成しグリオブラストーマLNZTA3細胞のlysateと混合した。LNZTA3細胞はテトラサイクリンでp53の発現量を制御できることからp53が発現の有無によってlysateを調製してキノフラシンが結合したアフィニティービーズと混合した。それぞれのアフィニティービーズに結合したタンパク質をSDS電気泳動、銀染色を行った結果、p53の発現したlysate特異的に結合したバンドを検出した。これらのバンドをLC-MS解析を行いキノフラシン特異的に結合する候補タンパク質を見出した。またIn vivo抗腫瘍効果を明らかにするために必要なキノフラシンを固体培養からアセトン抽出、HPカラム、HPLC等を駆使して精製をおこなった。キノフラシン、コッコキノンはi.p.によるマウス急性毒性の結果、50 mg/kgで毒性を示さないことが明らかとなった。
（平成29年度の成果の意義）ヒトグリオブラストーマLNZTA3においてp53発現したlysate特異的にキノフラシンに結合する候補タンパク質の同定、キノフラシン、コッコキノンの大量精製により平成30年度も研究計画に沿って研究の遂行が可能となった。
（平成29年度の成果の重要性）キノフラシンに結合する候補タンパク質の同定はキノフラシンのp53依存的細胞死のメカニズムの解明に、キノフラシン、コッコキノンの大量取得はin vivo抗腫瘍効果実験を可能にするための重要な成果である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（理由）in vitroにおけるキノフラシンのp53依存的細胞死の機構を解明するためにはキノフラシンの標的を明らかにすることが重要である。そのためにキノフラシンを架橋したアフィニティービーズに対してp53が発現したヒトグリオブラストーマLNZTA3細胞から調製したlysate特異的にキノフラシンに結合する候補タンパク質を同定し、それらの中からp53と関連性のあるタンパク質を絞り込むことが可能となりさらに、リコンビナントタンパク質を作製して直接キノフラシンと結合するタンパク質を決定し、タンパク質ーキノフラシンの結合によってタンパク質の機能への影響を解明することが可能となる。キノフラシン、コッコキノンはin vitroではp53依存的細胞死を示すがin vivoでの抗腫瘍効果については不明である。in vivoでの実験では大量の化合物が必要となるためこれらの化合物の大量取得が不可欠であった。従ってキノフラシン、コッコキノンが大量精製できたことでin vivoでの抗腫瘍効果を明らかにすることが可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
（今後の推進方策）昨年度の研究成果をもとに引き続き本研究を推進する。p53が発現したヒトグリオブラストーマLNZTA3細胞lysateでキノフラシンに特異的結合する候補タンパク質からまずp53関連タンパク質を絞り込む。その後、キノフラシンを架橋したアフィニティービーズとp53が発現したヒトグリオブラストーマLNZTA3細胞から調製したlysateのSDS-PAGE、候補タンパク質に対する抗体で検出する。検出したタンパク質とキノフラシンの結合が直接的かリコンビナントタンパク質を作成して確認を行う。キノフラシンとタンパク質の結合が確認できた際にはタンパク質の機能に対するキノフラシンの影響やタンパク質の過剰発現やsiRNAによる細胞増殖への影響を解析する。キノフラシン、コッコキノンのin vivo抗腫瘍効果を明らかにするために、がん細胞を移植したマウスに急性毒性の結果から毒性を示さない濃度の化合物量を投与する。抗腫瘍効果は化合物投与実験の終了後に腫瘍を取り出し、腫瘍体積、腫瘍重量を化合物投与群と非投与群で比較する。また化合物投与期間中のマウスの体重を測定し化合物による体重変化について解析する。
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