研究課題
加齢は体内時計の働きに影響を与え、睡眠の断片化やリズム振幅の低下、リズム周期の変化等をもたらすことが知られているが、その機序は完全には明らかになっていない。一方、β２ミクログロブリンは主要組織適合遺伝子複合体MHC Iの構成因子であるが、認知機能等の脳機能に対してプロエイジング因子として働いていることが明らかになった。そこで本研究では、β２ミクログロブリンが視床下部・視交叉上核に存在する中枢時計の機能を変化させ、体内時計の働きにおける加齢変化に寄与している可能性について遺伝子欠損マウス等を用いて検討し、その作用機序を明らかにすることを目的とした。平成28年度の研究では、１）β2ミクログロブリン投与が若齢マウス視交叉上核の時計遺伝子発現リズムおよび若齢マウス輪回し行動リズムに与える影響の解析と、２）β2ミクログロブリンの発現レベルに対する加齢および時計遺伝子変異の影響の解析を行った。その結果、β2ミクログロブリン添加（3-10 μg/mL）は濃度依存的に若齢（3ヵ月齢）PER2::LUCノックインマウスより培養した視交叉上核スライスの発光リズム周期を長くすることが明らかになった。一方、高感度CCDカメラを用いた発光イメージング解析では、β2ミクログロブリン添加（3-10 μg/mL）は濃度依存的に細胞間の発光リズム位相の同期を低下させることが観察された。したがって、β2ミクログロブリンは視交叉上核の細胞時計間の同期性を低下させることによってリズム周期に影響をもたらしている可能性が示唆された。一方、視交叉上核の内因性β2ミクログロブリンのタンパク質レベルは加齢に伴う血中濃度の増加の二次的影響であることが明らかになった。
2: おおむね順調に進展している
１）β2ミクログロブリン投与が若齢マウス視交叉上核の時計遺伝子発現リズムおよび若齢マウス輪回し行動リズムに与える影響の解析と、２）β2ミクログロブリンの発現レベルに対する加齢および時計遺伝子変異の影響の解析を行った。１）の研究では、β2ミクログロブリン添加（3-10 μg/mL）は濃度依存的に若齢（3ヵ月齢）PER2::LUCノックインマウスより培養した視交叉上核スライスの発光リズム周期を長くすることが明らかになった。予備実験では10μg/mLの濃度で検討したが、加齢マウスの血漿中濃度は2-3μg/mLであるため、3μg/mLの濃度でも有意な延長作用が観察されたため、生理学的濃度でも十分な作用を示すことが分かった。一方、高感度CCDカメラを用いた発光イメージング解析では、β2ミクログロブリン添加（3-10 μg/mL）は濃度依存的に細胞間の発光リズム位相の同期を低下させることが観察された。したがって、β2ミクログロブリンは視交叉上核の細胞時計間の同期性を低下させることによってリズム周期に影響をもたらしている可能性が示唆された。また、マウス個体レベルの評価として、β2ミクログロブリンの脳室内持続投与が若齢マウス（C57BL/6J）の輪回し行動リズムにおけるリズム周期や明暗再同調などのリズムパラメーターに対する作用を解析し、加齢マウスとの類似性を検討したが、顕著な影響は見られなかった。一方、２）の研究では、視交叉上核の内因性β2ミクログロブリンのタンパク質レベルは加齢に伴い増加したのに対し、mRNAレベルでは観察されず、末梢血中でのタンパク質レベルと同等だったため、末梢レベルでの変化が視交叉上核にもたらされていることが示唆された。また、Clock変異マウスではタンパク質レベルの差異は認められなかった。
β2ミクログロブリンは主要組織適合遺伝子複合体MHC Iの構成因子であり、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞では膜貫通ドメインを有するα鎖と非共有結合で会合している。一方、外来的に投与されたβ2ミクログロブリンは細胞内に取り込まれた後、小胞体内でMHC Iと会合し、細胞膜表面に輸送されることが報告されている。このMHC Iの細胞膜発現がβ2ミクログロブリンの作用に必須であるかどうかを検討するために、MHC I複合体の細胞膜輸送に必須なトランスポーターであるTap1の遺伝子欠損マウス（＝MHC I細胞表面欠損マウス）を用いて検討を行う。具体的には、交配によってPER2::LUCノックイン・Tap1欠損マウスを作成し、視交叉上核スライスの生物発光リズムに対するβ2ミクログロブリンの周期延長作用および減衰係数増加作用に対するTap1欠損の効果を検討する。Tap1欠損によりβ2ミクログロブリンの作用が消失することを予想しているが、作用が認められなかった場合は、Tap1のファミリーであるTap2の発現がMHC Iの発現を補償している可能性があり、これを定量PCRによって確認する。さらに、視交叉上核の時計機能の加齢変化には、アルギニンバソプレシン陽性細胞の密度低下や、前述したNAD+依存性タンパク質脱アセチル化酵素SIRT1の発現低下が報告されているため、β2ミクログロブリン慢性投与後の若齢マウスの視交叉上核をサンプリングし、それぞれ免疫染色およびウェスタンブロッティングによって検討し、β2ミクログロブリンと既知の加齢変化因子との関係を明らかにする。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (12件) (うち招待講演 2件)
PLoS One
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Neuropsychiatr Dis Treat
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