| 研究課題/領域番号 |
16K08544
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
酒井 克也 金沢大学, がん進展制御研究所, 助教 (10523318)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 受容体 / ペプチド / リガンド |
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| 研究実績の概要 |
組換えインスリン受容体（IR）タンパク質の発現と精製：IRに結合する環状ペプチドの親和性セレクションのために、IRの発現と精製を試みた。これまでの検討からIR細胞外領域 （IR-ECD）とFcの融合タンパク質はタンパク質発現量が少なく、正しくジスルフィド結合を形成していないIRが多いことが分かり、全長IRとして精製する方法に変更した。WGA親和性カラム、Niカラム、anti-Flagカラムを用いることで高純度に精製できたが、精製の各段階でIRのキナーゼ活性が失われてしまった。
界面活性剤のおよび精製法の検討：キナーゼ活性を保ったIRを精製するために、界面活性剤 ーミセルサイズ、イオン性（アニオン、カチオン）、非イオン性などー 数種類の検討を行った。また、精製方法として限外膜濃縮による凝集や変性を避けるため透析による方法を検討した。また、Affinity精製の方法としてNiカラム、anti-Flag Ab、anti-IR Abなど検討した。これらの結果からIRのキナーゼ活性保持が改善されたが、完全に保持することは困難であった。
ナノディスクによる可溶化IRの精製：ナノディスクは、不溶性タンパク質を取り囲む天然に近いリン脂質二重膜構造をとるナノ構造体であり、ナノディスクに組み込まれた目的タンパク質は、機能活性を維持すことが可能でる。IRタンパク質の機能を保ったまま精製するために、粗精製IRタンパク質をナノディスクに再構成する方法を試行している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
予定していたアッセイ系の確立は順調に達成した。IRタンパク質の発現、精製が当初予定より遅れている。これは上記したようにIR-ECD-Fcタンパク質が正しいタジスルフィド結合をとらないために発現が困難であることが判明し、全長IRの発現と精製に方法を変更したためである。全長IRの発現、精製は可能であることが分かったが、キナーゼ活性を維持したまま精製することが困難であった。そのため界面活性剤や精製方法を検討し、活性保持率は改善されたが、それでも多くの活性が失活することが分かった。活性を持つ精製度の高いIRを用意することが、環状ペプチドの親和性選択に重要であるので、膜タンパク質の活性を保つナノディスクに再構成する方法を試行している。現在までに、スモールスケールで良好な結果を得ている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ナノディスクに再構成をもちいて、環状ペプチドの親和性選択に十分な量のIRを精製する。環状ペプチドのRNAライブラリの調整は進めており、タンパク質を用意でき次第速やかにセレクションを行う。
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