| 研究課題/領域番号 |
16K08578
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
李 知英 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, プロジェクト講師 (20402860)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 1倍体ES細胞 / 細胞周期 / 半数性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではフォワードジェネティスにとても有効な１倍体ES細胞の半数性・多能性維持に関連する細胞周期及びシグナルカスケードを解明、可逆的な倍数性の制御が可能か検討することで半数性の維持をより完璧に制御できる実験系を構築を試みた。
申請者の前回の研究で細胞周期のG2期からM期への変換を抑制するWee1 阻害剤はPD166285とMK1775両方とも１倍体ES細胞の半数性維持に有効であることが明らかとなったが（特許出願中）、その因子の作用は100%ではなかったため、より安定な培養条件の最適化が必要であるため、半数性維持効率上昇のための新規ターゲット探索と効果検証を行った。
Wee1阻害剤によるcyclinB, cdc2複合体の制御だけではなくその近傍で働く因子 (14-3-3)もターゲットとして、それらの阻害剤やantagonist (R18, Difopein, BV02)の効果を検証した。その結果、14-3-3 蛋白質の阻害剤R18 添加培地は、高効率な細胞増殖性を示すとともに半数性維持能力を示すことが明らかとなった。cdc25の免疫染色から、R18 がcdc25 を不活性化する14-3-3を阻害することが示され、G2期からM期への変換 は半数性維持に重要であることが再び明らかとなった。
また、14-3-3を阻害することで、1倍体ES細胞の樹立効率が上昇されるのか否かを試した結果、R18とBV02によって1倍体ES細胞の樹立初期の１倍体細胞の比率が著しく上がっていた。
従って、14-3-3 の阻害は樹立された1倍体ES細胞の半数性維持に働くのとともに、その樹立が困難であった1倍体ES細胞の樹立時の増殖にも有効であるため、そのの阻害剤を用いることで1 倍体ES 細胞の安定的な樹立及び培養が可能になると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
先行研究で細胞周期のG2期からM期への変換を抑制するWee1 阻害剤は１倍体ES細胞の半数性維持に有効であることが明らかとなったが、より安定な培養条件の最適化が必要であるため、平成２８年度には 細胞周期調節による半数性維持のための培養条件の最適化のための研究を行った。
その結果、G2期からM期への変換 に働くcdc25 を不活化する14-3-3 を阻害することで、G2 arrest を防ぎ、１倍体ES細胞の半数性を維持できることができた。また、これらの14-3-3阻害剤は1倍体ES細胞の樹立にも効果的に１倍体ES細胞の増殖や生存に寄与するのが明らかとなったので、当初の計画どおり「半数性維持のための培養条件の最適化」を達成できたと思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度の結果を異なる実験系で再確認する。具体的には、Stringent assayを行って１倍体ES細胞のクローンを24個ずつフィーダーフリー状態で上記の阻害剤もしくはその組み合わせを添加して長期培養しながらFACSにより各クローンについて1倍体細胞の割合を測る。最終的に各実験群（n=24）の平均で長期培養における１倍体細胞率の変化推移を定量化する。
また、遺伝子改変による半数性と多能性維持と分化の制御のための研究を行うために、２倍体ESに比べて１倍体ES細胞に沢山発現する遺伝子をレンチウイルスで感染させてこれらの細胞で半数性が維持されるかどうかを検討する。
具体的には、1) Wnt10aとCxcl５のレンチウイルスベクターを作成し、そのレンチウイルスを用いて１倍体ES細胞を遺伝子改変する。上記の遺伝子の過剰発現はレンチウイルスベクターの蛍光レポーターにより蛍光顕微鏡で確認する。遺伝子改変１倍体ES細胞を各阻害剤有・無で培養した後、FACSにより１倍体細胞率を測り、上記遺伝子の半数性維持に関わる役割を検証する。2) Wnt10aとCxcl5を２倍体ES細胞に過剰発現させた場合、２倍体細胞が１倍体細胞に変換できるか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
旅費の使用が少なかったため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額はその他（受託解析料や実験機器使用料等）または物品費として使用する予定である。
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