| 研究課題/領域番号 |
16K08605
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
|---|
研究代表者 |
渡邉 裕介 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (20562333)
|
|---|
| 研究分担者 |
中川 修 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (40283593)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | 心臓発生 / CRISPR/Cas9 |
|---|
| 研究実績の概要 |
先天性心疾患は新生児100人に1人という高頻度に生じるが、そのうち心臓流出路領域から発生する大動脈・肺動脈の基部と右心室に関係するものが約30％を占める。流出路・右心室の心筋は「二次心臓形成領域 (Second Heart Field; SHF)」の心臓前駆細胞から発生し、「一次心臓形成領域」から発生する左心室とは異なる起源を有する。このSHFは先天性心疾患の病因解明や、再生医療における効率的な心筋分化誘導法の確立といった臨床的な見地から注目すべき組織である。
今年度は、SHF発生において重要な機能を担っているIslet1、Nkx2.5のホメオドイメインを含む2つの転写因子に注目し、CRISPR/Cas9ゲノム編集法によりエピトープタグを融合するようにノックインしたIslet1-FLAG、Islet1-HA、Nkx2.5-FLAGの3つのマウス系統を作製・樹立した。これらのマウス系統では抗FLAG抗体、もしくは抗HA抗体を用いたWestern blotや免疫染色により、マウス胚SHFで発現するIslet1-FLAG又はHA、Nkx2.5-FLAGの発現を確認できた。さらに、抗FLAG抗体、もしくは抗HA抗体により、Islet1、又はNkx2-5タンパク質を免疫沈降できることを確認した。特にIslet1に関しては、マウス胚ライセートを用いた免疫沈降により既知の相互作用因子であるLdb1が共沈されることを確認できており、作製したマウス系統が抗エピトープタグ抗体を用いた免疫沈降による結合因子の同定において有用であることを示した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定していたIslet1、Nkx2.5にエピトープタグを融合するようにノックインしたマウス系統の作製が終了した。これらのマウス系統では抗エピトープタグ抗体によるIslet1、Nkx2.5タンパク質の検出と免疫沈降が可能であり、質量分析へと進める状況となった。
|
| 今後の研究の推進方策 |
エプトープタグ融合Islet1、Nkx2.5マウス胚を用いて、抗エピトープタグ抗体による免疫沈降-質量分析を行い、Islet1、Nkx2.5の複合体構成候補因子を同定する。同定した因子の中から実際にIslet1、Nkx2.5と結合しているかを共免疫沈降、プルダウン実験で確認する。また、複合体構成因子がIslet1の標的遺伝子の転写活性においてどのような機能を担っているか、Luciferaseレポーターアッセイにより検討する。さらに、複合体構成因子の心臓発生における機能について、遺伝子改変マウスを導入、或は作製して解析を進める。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費として確保していたが今年度計画では使用しなかったため、14,384円の残額が生じた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画からは必要であり、次年度物品費として使用する。
|
