| 研究課題/領域番号 |
16K08613
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
久万 亜紀子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (30392377)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | オートファジー / 選択的基質 / 神経疾患 |
|---|
| 研究実績の概要 |
オートファジーは、細胞内成分をオートファゴソームとよばれる袋状の構造体で包み込み、リソソームへ運んで分解する細胞内分解システムである。神経特異的オートファジー遺伝子欠損マウスは神経変性疾患様の症状を示し、オートファジー欠損によるユビキチン化タンパク質の蓄積がその原因として考えられている。しかし、オートファジーの選択的基質の量的制御の破綻が病態の一因である可能性についてはほとんど検討されていない。よって本研究課題では、オートファジー選択的基質の異常蓄積による毒性が神経障害の原因の１つであるという仮説のもと、脳内におけるオートファジー選択的基質の同定を試みる。オートファジーの選択的基質は、オートファゴソーム局在タンパク質LC3およびGABARAPとLIRモチーフを介した相互作用により認識される。よって、(1)LC3またはGABARAPと結合する。(2)LIRモチーフをもつ(3)Atg5欠損細胞で蓄積する。という３つの条件を満たすタンパク質が候補となり、これらを満たすタンパク質の同定を試みる。平成28年度は、解析に用いるためAtg5F/F:Nestin-Creマウス、Atg5F/F:Nestin-Cre:GFP-LC3マウス、Atg5欠損新生仔マウスを準備し、脳サンプルを採取した。また、Atg5F/F:Nestin-Creマウスは時間依存的に神経症状が悪化するので、6カ月齢以上の脳サンプルを準備した。現在、解析のために十分な個体数のサンプルが用意できたので、免疫沈降、質量分析、組織免疫観察による解析を進める予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Atg5F/F;Nestin-Creマウスの神経症状は時間依存的に重篤化するので、6カ月齢以上のマウスを準備するために時間を要した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
Atg5F/F;Nestin-Cre;GFP-LC3の脳抽出液を用いて抗GFP抗体による免疫沈降実験を行い、共沈タンパク質を質量分析により同定する。また、Atg5F/F;Nestin-CreマウスおよびAtg5-/-マウスの脳サンプルにおいて存在量が上昇したタンパク質の同定を行い、オートファジーの選択的基質候補の洗い出しを試みる。また、組織染色により神経障害部位と基質蓄積部位の関係性を調べる。さらに神経培養細胞を用いて過剰発現による細胞への影響を解析する。これらの解析により、病態の原因となりうる選択的基質タンパク質の候補の絞り込みを行い、最終的には候補タンパク質の過剰発現マウスを作製して病態との関係性を検証する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
Atg5F/F:Nestin-Cre:GFP-LC3マウス作製に時間がかかり、平成28年度中にMS解析に用いる脳サンプルを準備できなかったため、本年度にMS解析用の費用を持ち越した。現在、Atg5F/F:Nestin-CreマウスおよびAtg5KO新生児の脳サンプル準備が終わり、Atg5:Nestin-Cre:GFP-LC3マウスは準備途中である。サンプルが揃い次第MS解析に進む。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
脳サンプルのMS解析を委託するための費用として計上する。
|
