| 研究課題/領域番号 |
16K08667
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
岡 剛史 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (50160651)
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| 研究分担者 |
大内田 守 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (80213635)
岡田 康志 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, チームリーダー (50272430)
吉野 正 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (70183704)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | HTLV-I / ATL / DNAメチル化 / １細胞解析 / ライブセルイメージング |
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| 研究実績の概要 |
成人T細胞白血病・リンパ腫（ATL）はとくに病期の進んだ症例の予後は大変不良であり、このような難治性リンパ腫・白血病をどのように扱うかは焦眉の課題となってきている。ATLはHTLV-Iを原因ウイルスとする疾患であるが、現在のところ有効な治療法が確立されていない。このような臨床病理学的特徴がどのような分子基盤によって成り立っているか明らかにするためにATL患者検体、培養細胞、動物モデル等の様々な実験系によりエピジェネテイック異常に焦点を当てATL発症機構について包括的網羅的解析法を駆使しながら様々な角度から総合的且つ詳細に解析する事を目的としている。我々はHTLV-Itax遺伝子発現のON/OFFがコントロールできる培養細胞においてDNAメチル化を定量的に計測するライブイメージングシステムの構築を試み成功している。既に予備実験よりtax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化が誘導された後、異常DNAメチル化が起こることを確認し，その際多数のhyper-methylation fociが新たに形成されることを発見した。この実験系を用いて生きた状態で細胞内部環境及び外部環境の変化に応答してエピジェネテイック状態がどのようにダイナミックに変化するか解析をする。とりわけDNAメチル化ライブイメージング法及びトランスジェニックマウスを用いて内部環境及び外部環境の変化に応答するDNAメチル化及びヒストン修飾の動的変化を１細胞レベル及び組織レベルでライブ解析し、HTLV-I感染がどのように異常DNAメチル化を誘導するのか、また悪性腫瘍形質の獲得及びATL発症の機構を詳細に解析する。そのことにより，ハイリスクHTLV-Iキャリアの同定し、ATL発症及び低悪性度ATLから高悪性度ATLへの進展の早期発見・早期診断技術の開発、また有効な新規治療法の開発につなげる事を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
フローサイトメトリ（FACS）を用いた細胞周期解析方法と細胞周期変動に応じたDNAメチル化レベルの変動をEGFP蛍光検出により同時計測をした。我々は既に予備実験よりHTLV-I tax遺伝子ONの後、一過的なグローバルDNA脱メチル化誘導の後、引き続き異常DNAメチル化が起こることを確認し，多数のhyper-methylation focusが新たに形成されていることを観察している。更にHTLV-Itax遺伝子発現ONにした後、細胞の DNAメチル化レベルの変動パターンの経時的変化を追跡し、異常DNAメチル化がおこるのに必要とされる時間依存性をさらに詳細に解析した。FACS解析で観察されるグローバルDNAメチル化レベルの変動解析と平行して共焦点レーザー顕微鏡及び超高解像度STED顕微鏡によるメチル化DNAのhyper-methylation foci，Tax蛋白質の時間・空間局在分布変動を１細胞レベルで検討することにより新たにDNA methylationが起こっている現場でどのようなことが起こっているのか詳細に解析した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後FACS解析で観察されるグローバルDNAメチル化レベルの変動解析と平行して共焦点レーザー顕微鏡及び超高解像度STED顕微鏡によるメチル化DNAのhyper-methylation foci，Tax蛋白質, DNMT1,3a,3bなどDNAメチル化蛋白, Tet1,2,3等DNA脱メチル化蛋白、ポリコーム遺伝子群蛋白発現の時間・空間局在分布変動を１細胞レベルでshRNAによるノックダウン細胞と対比しながら詳細に検討することにより、新たにDNA methylationが起こっている現場でどのようなことが起こっているのか詳細に解析を行う。また白血病細胞の長期ライブイメージングによるエピゲノム状態の経時変化の定量化を行う。
更に次世代シーケンス技術により、DNAメチル化のBisulfite Sequencing, 及びRNA sequencingによりどのようなターゲット遺伝子が時間依存性にどのようにDNAメチル化変動しているか詳細に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の実験に於いては消耗品の使用を少し節約できたため次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は翌年度分とあわせ消耗品等の支出に使用する予定である。
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