| 研究課題/領域番号 |
16K08699
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
塩竈 和也 藤田保健衛生大学, 医療科学部, 助教 (10387699)
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| 研究分担者 |
尾之内 高慶 藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (20632954)
堤 寛 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80138643)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 好中球細胞外トラップ（NETs） / NETosis / lactoferrin / フィブリン / 免疫染色 / ホルマリン固定パラフィン切片 |
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| 研究実績の概要 |
「医学研究倫理審査委員会」へ研究申請書を提出し、客観的な審査を受けて臨床検体使用の承認を得た。本学大学病院に保管されているホルマリン固定パラフィンブロックのうち、HE染色で好中球浸潤と網目状構造物が目立つ線維素化膿性炎の大葉性肺炎、膿瘍および虫垂炎を各30例ずつ選出した。さらに、病理標本中の血管内皮細胞を目安として、網目状構造物を細い線維、太い線維および塊状の線維の3種類に分類した。代表症例を用いて、諸種マーカーを用いた免疫染色の至適検出条件の設定を行った。核成分の証明として、一本鎖DNA、シトルリン化histone H3の2種類、好中球細胞質成分の証明として、一次顆粒に対する抗体がmyeloperoxidase (MPO)、neutrophil elastase (NE)、lactoferrin（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）の4類を好中球細胞外トラップ（Neutrophil extracellular traps: NETs）マーカーとした。
細い線維および太い線維のいずれにおいても、lactoferrinが最も検出率が高いNETsマーカーだった。細い線維はNETsが多くを占めており（14/18例, 78%）、好中球の破壊が目立ち、ヘマトキシリン好性の領域にNETsが高頻度に認められる傾向があった。太い線維の大半はフィブリンであり（17/23例, 74%）、多くの場合、NETsと共発現していた（18/23例, 78%）。塊状の線維は、いずれもフィブリンだった。細い線維は、lactoferrin以外の好中球細胞質成分マーカーが陽性を示したが、太い線維はいずれも陰性だった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度は、ほぼ研究計画どおりに進行している。一部実現できなかった項目が課題として残っており、次年度の研究計画と並行しながら進めていく。
現在までに得られた結果は以下の6点である。①線維のサイズに関わらず、lactoferrinが最も安定したNETsマーカーだった。細い線維では、シトルリン化histone H3の14/18例（78%）、lactoferrinの18/18例（100%）、MPOの17/18例（94%）およびNEの16/18例（89%）が陽性を示した。太い線維では、シトルリン化histone H3の7/23例（30%）、lactoferrinの18/23例（78%）、MPOの11/23例（48%）およびNEの12/23例（52%）が陽性を示した。②細い線維は多くの場合NETs成分が含まれていた。NETs単独発現が14/18例（78%）、NETsとフィブリンの共存が7/18例（39%）であり、フィブリンマーカーのみが陽性を示す症例は認められなかった。③ヘマトキシリン好性の細い線維は、NETs形成の時期的な影響によりシトルリン化histone H3（NETｓ早期マーカー）のみが陰性を示した。④太い線維はNETsとフィブリンの共存が18/23例（78%）、フィブリンのみが17/23例（74%）と多くを占め、NETsのみの発現は認められなかった。⑤塊状の線維はフィブリンであり、NETs成分は含まれなかった。⑥線維サイズの違いにより、NETsあるいはフィブリンの予測はある程度可能だったが、NETsとフィブリンの共存における両者の鑑別は、HE染色レベルでは鑑別困難だった。Lactoferrinを中心としたNETsマーカーおよびフィブリンマーカーを用いた免疫染色を行うことで、NETsとフィブリンを明確に鑑別することに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究目的を達成するための次の計画として、細胞診標本を用いたNETsの検出ならびにフィブリンとの鑑別を行う。Class IIあるいはNILM症例で炎症が強く、網目状構造物が確認される胸腹水、喀痰および子宮頚部擦過材料を各50例ずつ選出する。Class IIあるいはNILM症例は、3年間保管されたのち廃棄されるため、廃棄対象の標本から最適な症例を選出する。選出した症例は、目的箇所を確認したのち、非水溶性封入剤を用いた細胞転写を行う。すでに本学「医学研究倫理審査委員会」から臨床検体使用の承認を得ているため、新たに承認を得る必要はない。NETsマーカーは、ホルマリン固定パラフィン切片を用いた免疫染色で良好な染色性を示したlactoferrinおよびシトルリン化histone H3を中心に、MPOおよびNEを加えた4種類を単独抗体および混合抗体として用いる。線維のサイズや染色性、背景に分布する好中球の形態などに着目して、免疫染色の結果と比較する。さらに、子宮頚部擦過細胞診標本中に潜む善玉菌（常在菌）のデーデルライン桿菌および悪玉菌のガルドネレラ菌をlocked nucleic acid (LNA) / DNAキメラプローブを用いた高感度in situ hybridization (ISH)法によって同定する。膣内の自浄作用に関与するデーデルライン桿菌と、細菌性膣炎の主な原因菌であるガルドネレラ菌において、NETsがどのように関与しているのか詳細に解析する。NETsおよびフィブリンの染色性が良好な症例を選出して、pre-embedding免疫電顕によって特異性を確認する。金コロイド（二次抗体標識コロイド）のサイズを変えた免疫電顕によって、NETsとフィブリンの分布およびサイズを電顕レベルで解析する。すべてのデータ解析後、最終年度に備えて成果発表と英文論文に取りかかる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
以下に示す3項目を遂行するため、平成29年度において予算が必要である。１）細胞診標本におけるNETsおよびフィブリン検出のための免疫染色。２）子宮頚部擦過細胞診標本におけるデーデルライン桿菌およびガルドネレラ菌検出のための高感度ISH法。３）NETsおよびフィブリン免疫染色における特異性を確認するための免疫電顕。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現有備品の老朽化による測定精度低下のため、卓上型pHメーターを購入する（HORIBA社スタンダードToupH電極セット、F-72、\230,000）。それ以外の研究費の大半は、実験消耗品にあてる。高感度ISH法に用いるプローブは、いずれの細菌においても16s rRNAを標的したLNA/DNAキメラプローブを50塩基前後の長さに設計して受託合成する。高感度ISH法では、市販のチラミド増感試薬（Dako社製CSAII kit）を検出キットとして採用しているため、必要分を適宜購入する。組織切片ならびに細胞転写標本作製のための試薬・用品、ISH法用試薬・器具、免疫染色用試薬・器具、電顕用試薬・器具を適宜追加購入する。学会発表のための国内旅費、英文論文の校正・校閲を外部依頼するための謝金、印刷費も必要である。
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