| 研究課題/領域番号 |
16K08716
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
谷水 直樹 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00333386)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 分化可塑性 / 前駆細胞 / 肝細胞 / 組織再生 |
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| 研究実績の概要 |
肝細胞のHeterogeneityを明らかにするために、健常マウスの肝臓から分離したICAM-1(+)肝細胞と成熟肝細胞の比較をRNA sequencingを用いて行った。ICAM-1(+)細胞が成熟肝細胞と比較してcytochrome P450の発現などが低いことなどが明らかになった。また、ICAM-1(+)肝細胞分画には、単核の細胞が濃縮していることが分かっていたが、さらにFACSを用いた生細胞の解析から、diploidの細胞が濃縮していることも明らかになった。
肝細胞の分化可塑性の制御メカニズムを明らかにするために、成熟肝細胞とSox9(+)肝細胞を比較したMicroarrayデータから、Sox9(+)肝細胞に特異的に発現する遺伝子としてFosbおよびTrib1を抽出した。その他の候補遺伝子ついても、PCRで発現上昇を確認中である。
肝細胞の脱分化がNotch signalによって促進されること、一方、Grhl2によって分化転換が制御されることを明らかにするために、Notch細胞内ドメイン(NICD)あるいはGrhl2の遺伝子をvirus vectorを用いてin vitroにおいて肝前駆細胞に導入した。Grhl2は、３次元培養において胆管上皮細胞様の構造を誘導したが、NICDにそのような効果はなかった。また、Grhl2とNotch signalが誘導する胆管上皮細胞マーカーが異なることも明らかになった。さらに、両遺伝子をHTVi法によって肝細胞に導入する実験を行った。NICDを導入した場合には、速やかに肝細胞の脱分化を示す遺伝子発現が確認された。一方で、いずれの因子あるいは両方の因子を導入しても、一週間程度では、胆管上皮細胞への分化転換は起こらないことがわかった。
DEN投与肝発癌モデルの検討から、腫瘍内にSOX9(+)細胞が出現するものの、SOX9(-)の細胞も混在していることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
正常肝臓の肝細胞のHetergeneityを明らかにするために、成熟肝細胞と肝前駆細胞との比較をMicroarrayを用いて行った。最終的な候補分子の絞り込みには至っていないが、今後更なる検討によって新たなマーカーが同定できる可能性を示すことができた。
前駆細胞を培養した場合、分化能を維持した細胞株と、分化能が低下した細胞株が得られた。詳細は明らかではないが、遺伝子発現の差やEpigenetic修飾の違いを検討することで、肝前駆細胞維持機構を明らかにできる可能性を示せた。
DEN投与肝細胞癌誘導モデルにおいて、SOX9やOPNが誘導されるが、誘導は一様に起こらず、腫瘍内にも、SOX9(+)SOX9(-)細胞が混在することがわかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
健常マウスの肝臓から分離したICAM-1(+)肝細胞には単核でdiploidの細胞が濃縮していることが明らかになった。そこで、FACSでdiploidの細胞を単離することで、diploidの細胞が増殖能の高い細胞であるかの検討や肝前駆細胞に特異的な遺伝子発現プロファイルを明らかにすることを試みる。
SOX9(+)肝細胞特異的な遺伝子を、in vitroで肝前駆細胞に導入し、増殖能や分化能に影響を与えるかを検討した後、in vivoにおいて強制発現あるいはノックダウンする方法を検討する。Microarrayのデータのみでは発現の上昇が明確ではなった遺伝子について、定量PCRを行い、さらにSOX9(+)肝細胞で特異的な遺伝子の候補を得る。引き続き、SOX9(+)肝細胞の分離を行い、抗原として用いる量の確保に努める。
Notch signalとGrhl2による肝細胞脱分化・分化転換については、遺伝子発現誘導後、長期の観察、障害の負荷などを行い、遺伝子発現の変化と組織切片の解析を行って、肝細胞の脱分化・分化転換について検討する。蛍光標識したNotch細胞内ドメインやGrhl2の導入を行った後に、遺伝子導入後の細胞を分離することで、それぞれのシグナル、遺伝子発現による肝細胞の性状変化を分子レベルで明らかにすることを試みる。
肝臓で形成された腫瘍内のSOX9(-)細胞とSOX9(+)細胞の相違点を明らかにするために、腫瘍からの細胞分離を行い、さらにFACSを用いてSOX9(-)/(+)細胞の分画を試みる。分離した細胞の増殖能やSphere形成能などを比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子発現の網羅的解析から前駆細胞特異的な遺伝子の候補が得られたが、さらなる解析を次年度にて行うことにしたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度前半に、定量ＰＣＲを行うことで、前駆細胞に特異的な遺伝子の同定や成熟肝細胞の脱分化を制御する候補遺伝子を同定する。
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