| 研究課題/領域番号 |
16K08716
|
|---|
| 研究機関 | 札幌医科大学 |
|---|
研究代表者 |
谷水 直樹 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (00333386)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | 肝細胞 / 脱分化 / 肝前駆細胞 / 組織再生 |
|---|
| 研究実績の概要 |
我々は、健常マウスの肝臓から分離したICAM-1(+)肝細胞が肝前駆細胞としての性質を示すことを見出した。ICAM-1(+)肝細胞分画には、単核の細胞が濃縮していることが分かっていたが、さらにFACSを用いた生細胞の解析から、diploidの細胞が濃縮していることも明らかになった。そこで、diploidの細胞をFACSで分取し、その性状解析を行った。ICAMICAM-1(+)肝細胞と成熟肝細胞の比較を行ったRNA sequencingの結果を参考にし、分化マーカーなどの発現をPCRによって調べた。その結果、特に、Glutamine synthetaseやcytochrome P450の発現は、成熟肝細胞 > tetraploid ICAM-1(+) > diploid ICAM-1(+)の順に発現が低くなっていることが明らかになった。また、diploidの細胞は、tetraploidの細胞よりも高い増殖能を示すことも明らかになった。以上の結果から、健常肝臓の幹前駆細胞はdiploid ICAM-1(+)細胞の分画に濃縮しており、それらの細胞は中心静脈周囲には存在していない可能性が高いことが明らかになった。
肝細胞の脱分化がNotch signalによって促進されること、一方、Grhl2によって分化転換が制御されることを明らかにするために、Notch細胞内ドメイン(NICD)あるいはGrhl2の遺伝子をHTVi法によって肝細胞に導入する実験を行った。NICDを導入した場合には、速やかに肝細胞の脱分化を示す遺伝子発現が確認された。両遺伝子を肝細胞に導入し、慢性肝障害を負荷すると、一部の細胞が胆管上皮細胞様の細胞に変化していることがわかった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
肝細胞のHeterogeityを明らかにする実験では、細胞表面マーカーの発現パターンに加えて、染色体の倍数性の違いで細胞を分画する方法も取り入れて、Diploid ICAM-1(+)細胞に前駆細胞が濃縮されていることがわかった。
肝前駆細胞の分化・成熟を制御する分子の解析については、ノックダウンの実験系を整備するの時間を要したため、進捗が遅れているので、30年度に集中して実験を行う予定である。
肝細胞の分化転換を制御するメカニズムについては、Notch signalの活性化と、Grhl2の発現に加えて、慢性肝障害に晒されることで、胆管上皮細胞へと分化転換することが明らかになったことからも、順調に進んでいる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
SOX9(+)肝細胞特異的な遺伝子の機能解析を行う。まず、肝前駆細胞でこれらの遺伝子のノックダウンを行い、コロニー形成能と肝分化能への影響を検討する。肝前駆細胞の増殖・分化に影響を与えた遺伝子について、Hydrodynamic tail vein injection法を用いて肝細胞にノックダウンベクターを導入した後に、慢性肝障害を負荷し、肝前駆細胞の出現頻度を解析することで、肝細胞の前駆細胞化における機能を明らかにする。ROSA-CAG-tdTomatoマウスにpLIVE-Creを導入することで、ノックダウンが起こっている細胞を識別できるようにしておく。
ICAM-1(+)細胞をdiploidと tetraploid細胞に分画する実験を継続し、遺伝子発現解析に用いるための細胞を確保する。遺伝子発現解析をRNA sequenceによって行い、健常肝臓における肝前駆細胞特異的なマーカーの同定を試み、肝組織内での存在場所を明らかにする。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
diploid ICAM-1(+)細胞とTetraploid ICMA-1(+)細胞の遺伝子発現解析を本年度中に行う予定であったが、細胞数を集める必要から、次年度に実験を実施することに変更した。
|
