| 研究課題/領域番号 |
16K08754
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| 研究機関 | 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所) |
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研究代表者 |
川上 恭司郎 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究員 (90589227)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | エクソソーム / ミクログリア / 神経炎症 / プロテオーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究は炎症時に存在する細胞外ヒストンの細胞障害性に関して、エクソソーム上のヒストンがその役割の一部を担っている可能性を活性化ミクログリア由来のエクソソームを用いて、細胞および動物レベルにおいて明らかにすることを目的としている。今年度は以下の実験を行った。
【①活性化ミクログリア細胞株由来エクソソームのプロテオーム解析】無血清培地で培養したBV2（マウスミクログリア細胞株）にLPS、アミロイドβ、IL-4を処理し、翌日に培養液を回収し、エクソソームを超遠心法で精製した。精製したエクソソームをトリプシン消化後にiTRAQで標識し、標識ペプチドを定量プロテオーム解析にかけることにより約1000個のタンパク質を同定した。定量解析によりそれぞれの処理で発現量に差のあるタンパク質を選出した。
【②マウス凍結脳エクソソームの単離】マウス凍結脳を用いて脳組織内に存在するエクソソームを単離する超遠心法の改良法を昨年度に報告した。今年度は超遠心法以外の方法を用いて、精製度の高い脳エクソソームを単離する目的で免疫沈降法による生成を試みた。その結果、免疫沈降法により回収した脳エクソソームにエクソソームマーカーを検出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
BV2細胞にLPSなどを処理し、翌日回収した培養上清から超遠心法で得られたエクソソームを定量プロテオーム解析することによりLPSなどによって発現変化を生じるタンパク質を見出している。また、マウス凍結脳からのエクソソーム単離では超遠心法ではなく、より精製度が高いと考えられる免疫沈降法による単離でもエクソソームマーカーを検出している。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞レベルではBV2細胞にLPSなどを処理し、培養上清に放出されたエクソソームを回収し、それらエクソソームを神経細胞モデルPC12細胞やBV2細胞自身に投与し、細胞への障害性などの影響を見る。さらにヒストンの細胞障害性を抑制する物質やエクソソームの取り込みを阻害する物質の処理により細胞への影響が軽減されるかを検討する。
動物レベルではアルツハイマー病モデルマウスより脳エクソソームを単離し、ヒストンの発現変化など、細胞実験レベルで得られた知見が動物でも同様にみられるか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
エクソソームに関する研究は本研究以外にも行っており、他の研究の試薬と共通するものが多く、使用期限を考慮して既に購入済みの試薬を先に使用するなど、予定の試薬の購入を遅らせる事態が発生したが、基金である利点を活用し、翌年分にスライドすることが可能であったため商品の重複購入を避けることにした。これから細胞培養、超遠心、プロテオーム解析、ウエスタンブロット解析、組織染色、抗体、動物など研究計画に基づき無駄なく執行していく予定である。
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