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2016 年度 実施状況報告書

miRNAノックダウン住血吸虫を用いた細胞外小胞における性成熟への機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 16K08756
研究機関東京医科歯科大学

研究代表者

熊谷 貴  東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (40369054)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード住血吸虫 / miRNA / miR-Bantam / レンチウイルス / Tough Decoy
研究実績の概要

当該年度の目的の一つは、日本住血吸虫のmiRNA(miR-SjBantam)を標的としたノックダウンシステムの開発である。今回、miRNAの機能・発現を阻害する”Tough Decoy miRNA blocking system"を採用した。この方法は、標的となるmiRNAに結合可能だが機能を競合する配列を人工的に作成し、細胞内で発現させることで、標的となるmiRNAの機能を阻害し恒常的なノックダウン状態にする方法である。今回、この方法を導入するにあたり、以下の作業を行った。1)日本住血吸虫の小分子RNA発現用プロモーター領域(U6プロモーター)の同定、2)miR-SjBantamを標的としたTough Decoy miRNAの設計と作成、3)作成した遺伝子領域のレンチウイルスへの挿入とウイルス作成。
当該年度の成果としては、初めに導入するTough Decoy miRNAを発現させるためのプロモーターを導入することが必要であり、そのために既知のマンソン住血吸虫のU6プロモーター配列を元に日本住血吸虫での該当配列をデータベースから見つけた。この配列をベクター中にクローニングを行なった。次に、miR-SjBantamの配列を元にTough Decoy配列を設計し、これをプライマー伸長法により合成し、PCRで増幅した該当配列をベクターにクローニングした。これらの2つのベクターの挿入配列を結合させ、レンチウイルスベクターに挿入することで完成させた。このベクターは293T細胞に導入し、上清よりレンチウイルスを回収した。ウイルス力価はリアルタイムPCR法により測定し、十分量のウイルスが回収できた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は本研究課題の準備段階としての、miRNAノックダウンのためのツールの開発がメインであった。今回、その一つであるmiR-SjBantamに対するTough Decoy配列を有するレンチウイルスを作成できたのは、本目的の一つの到達点であった。

今後の研究の推進方策

今後は作成したレンチウイルスを用いて、実際に日本住血吸虫の幼虫にウイルスを感染させ、遺伝子導入についての検討を行う。まず、培養下において、日本住血吸虫の幼虫に作成したTough Decoy miRNAを含んだレンチウイルスを感染させ、ゲノムへの遺伝子導入、導入遺伝子の発現確認を行う。その後、実際に標的となるmiRNAの発現調整への関与、miRNAの標的となる既知遺伝子の発現変動についての確認を行い、どのような形態変化が起こるのかや、同時に性成熟・産卵への影響について観察を行う。また、同時に、幼虫だけではなく、成虫への遺伝子導入も行い、ペアリングへの影響やmiRNAの発現状況についても同様の確認を行う。また、これまで調べられていない虫卵やその中の幼虫についても同様の検討を行い、多角的なアプローチによってmiRNAの機能について検討を行う予定である。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Novel synthetic compounds with endoperoxide structure damage juvenile stage of Schistosoma mansoni by targeting lysosome-like organelles.2017

    • 著者名/発表者名
      Yamabe M, Kumagai T, Shimogawara R, Blay EA, Hino A, Ichimura K, Sato A, Kim HS, Ohta N.
    • 雑誌名

      Parasitol Int.

      巻: 66 ページ: 917-924

    • DOI

      10.1016/j.parint.2016.10.013

    • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
  • [学会発表] レンチウイルスを用いたmiRNAノックダウン住血吸虫の作製2016

    • 著者名/発表者名
      熊谷貴、山邊将史、下河原理江子、太田伸生
    • 学会等名
      第24回分子寄生虫学ワークショップ/ 第14回分子寄生虫・マラリア研究フォーラム合同大会
    • 発表場所
      帯広畜産大学・原虫病研究センター・PKホール(北海道帯広市)
    • 年月日
      2016-08-21 – 2016-08-24

URL: 

公開日: 2018-01-16  

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