| 研究課題/領域番号 |
16K08767
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
冨田 隆史 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 主任研究官 (20180169)
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| 研究分担者 |
葛西 真治 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 室長 (80332360)
駒形 修 国立感染症研究所, 昆虫医科学部, 主任研究官 (20435712)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 殺虫剤抵抗性機構 / シトクロムP450 / ゲノム編集 / 遺伝子ノックアウト / ネッタイシマカ |
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| 研究実績の概要 |
ネッタイシマカは熱帯地域における最も重要なデング熱媒介蚊であり，本種のピレスロイド系殺虫剤に対する抵抗性の発達が防除上の大きな問題となっている。シトクロムP450（CYPと略）は殺虫剤化合物を含む脂溶性物質の一次代謝を担う酸化酵素で，本蚊種には約160種のCYP遺伝子が存在する。本研究では，ピレスロイド代謝抵抗性機構に含まれるシトクロムP450分子種をゲノム編集技術を利用して特定し，さらには，その発現量または代謝活性を変更する原因となる遺伝的変異を解明することを目的としている。
2017年度には，ピレスロイド抵抗性のSP系統の蚊においてピレスロイド代謝抵抗性要因と遺伝学的に連関することが示されている第１染色体右椀の特定の領域の中から，SP系統において殺虫剤感受性系統に比べて６倍過剰発現しているCYP6BB2遺伝子をノックアウトの標的として選び，CRISPR/Cas9システムに基づいて受精卵へのマイクロインジェクションによる変異の誘発を行った。その後の無処理SP蚊との交配により，コード領域に生じた単一の１塩基置換変異に由来するCYP6BB2のノックアウト遺伝子(KO)が野生型遺伝子(+)とともに含まれる１頭の処理雌に由来するラインを維持し，このラインの雌成虫について非致死となる一定量の14C-ペルメトリンの局所施用を行い，ペルメトリンの虫体残留量と排泄量を測定した。KO/KO遺伝子型（平均排泄率 70.1％）は，KO/+ (66.8%) および+/+ (62.4％) のそれぞれとの比較において有意な排泄率の低下が示されたことから，CYP6BB2はピレスロイド代謝抵抗性機構に含まれる分子であることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2016年度に同様な方法で研究を行ったCYP6AA5v2に関しては，ネッタイシマカSP系統のピレスロイド代謝抵抗性機構に含まれる根拠は得られなかったが，2017年度に標的としたCYP6BB2はピレスロイド代謝抵抗性機構に含まれる分子であることが示された。しかしながら，ペルメトリン排泄率を指標としたKO遺伝子の効果が最も表れやすいと考えられるKO/KOと+/+の間の比較において，有意差はあったものの劇的な排泄率の低下は示されなかった（すなわち，両遺伝子型が表す排泄率の分布に一部重複があった）ことから，SP系統の代謝抵抗性機構において最も重要なCYP分子種が本種ゲノムデータベースの未整備等の原因により見過ごされている可能性も浮上した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ピレスロイド抵抗性系統SPにおいて，CYP6AA5v2とCYP6BB2は共にピレスロイド抵抗性要因が遺伝学的にマップされる第1染色体の特定領域に存在し，かつ過剰発現性を示すことから，これら遺伝子を抵抗性機構に含まれる候補遺伝子として研究対象としてきた。これまで数メガバイト離れて位置すると見られていたこれらの2つの遺伝子座は，2017年にネッタイシマカのゲノムアセンブリが改訂された結果，約50 Kbの距離に位置し，しかも，これらの間には未命名のCYP遺伝子が座上していることがわかった。2018年度は，これまでの我々の既知CYP遺伝子の発現量に関する網羅的解析から抜け落ちていたこの未命名CYP遺伝子を新たな対象とし，その質的・量的発現に関する変異ならびに抵抗性機構への寄与を前年度と同様な方法で確かめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：年度末納品等にかかる支払いが2018年4月1日以降となったため，当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。2017年度分についてはほぼ使用済みである。
使用計画：上記のとおり。
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