C型とD型ボツリヌス毒素遺伝子を伝達するファージの宿主認識機構の解明とその応用

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08785
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 阪口 義彦 北里大学, 医学部, 講師 (70403491)
• 研究分担者: 林 俊治 北里大学, 医学部, 教授 (40260765) ; 加藤 はる 国立感染症研究所, 細菌第二部, 室長 (00273136) ; 大宮 直木 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (00335035) ; 内山 淳平 麻布大学, 獣医学部, 講師 (20574619) ; 妹尾 充敏 国立感染症研究所, 細菌第二部, 主任研究官 (20646624)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ボツリヌス菌 / ボツリヌス症 / ボツリヌス毒素遺伝子 / バクテリオファージ / 水平伝播 / ファージ変換 / ゲノム解析 / プロテオーム解析

研究実績の概要

ボツリヌス菌は、極めて強力な神経毒素（ボツリヌス毒素）を産生し、ヒトや家畜（ウシ）、家きん（トリ）に重篤な感染症（ボツリヌス症）を引き起こす。生産現場である農場で、ウシやトリのボツリヌス症が発生すると、生産者への経済的な損失や消費者への食の安全に対する不安感を助長させる。原因となるC型とD型毒素の遺伝子は、バクテリオファージ（ファージ）により伝播されている。その伝播を阻害することが、農場への被害を抑えるのに有効であると考えた。しかしながら、ボツリヌス菌（宿主菌）へのファージの吸着メカニズムは未だ明らかでない。そこで、まず、ファージの構造タンパク質（尾部吸着分子を含む）をコードする遺伝子情報を得るため、D型ボツリヌス菌ファージ（d-1873）のゲノム解析を行うこととした。d-1873ファージの全ゲノム塩基配列を決定したところ、ゲノムサイズは186 kbpで、151個のopen reading frame (orf) を確定できた。既に報告したC型ボツリヌス菌ファージ（c-st）とd-1873ファージのゲノム構造を比較すると、boNT/D遺伝子および DNA複製に関係する遺伝子を含む領域（45－100 kbp）がよく保存されていた。しかしながら、boNT/D遺伝子の上流領域 (1－45 kbp) および下流領域（100－115 kbp）は、c-stファージのゲノム構造とは著しく異なっていた。特に、下流領域は、ファージの構造タンパク質をコードする遺伝子群であることが推察された。この結果から、c-stファージとd-1873ファージの構造タンパク質は、異なる抗原性であることが推察された。現在、宿主特異性に関わるファージ尾部吸着分子をコードする遺伝子の解析を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

二種病原体等を用いた実験においては、国立感染症研究所（以下、「感染研」と称する）で行っている。感染研では、既に二種病原体等の所持許可が得られていること、感染研の加藤はる氏と妹尾充敏氏は、本研究課題の研究分担者であることから、同じ施設で研究分担者らの実験および解析技術の的確なサポートを受けられている。従って、研究の支援体制が非常に整っていることから、効率よく実験が進められている。研究代表者（阪口義彦）は、感染研での病原体等の安全な取扱及び管理に関するバイオリスク管理講習会において所定の課程を修了し、BSL2病原体等の取扱者として承認済みである。現在、感染研での組換えDNA実験安全委員会の承認を得て、ファージ尾部吸着分子に関する解析を進めている。

今後の研究の推進方策

中型恒温振盪培養機一式を用いて、組換えファージの尾部吸着分子の発現・精製を行い、得られた遺伝子産物のボツリヌス菌（宿主菌）に対する吸着を調べる。
1）c-stとd-1873ファージ尾部吸着分子の作製…組換えc-stとd-1873ファージの尾部吸着分子の発現（ベクター、宿主、培養など）と精製（アフィニティ担体など）の条件検討を行う。
2）ファージ尾部吸着分子の吸着能測定…HRP標識したファージ尾部吸着分子をPVDF膜へ固定したボツリヌス菌に反応させ、ファージ尾部吸着分子の菌体に対する吸着を検討する。
3）ポリクロナール抗体の作製…組換えファージ尾部吸着分子をウサギに免疫し、抗ファージ尾部吸着分子抗体を作製する。
4）免疫電子顕微鏡法…精製したファージ粒子を作製した精製抗ファージ尾部吸着分子抗体（一次抗体）と金コロイド結合抗ウサギ抗体（二次抗体）を反応させ、電子顕微鏡により観察する。

次年度使用額が生じた理由

次年度の研究計画では、組換えファージ尾部吸着分子の発現・精製、その遺伝子産物の機能を解析する。今年度の未使用額は、次年度に繰り越して、本実験で使用する培地やアフィニティー担体などを購入し、研究を遂行することにした。また、研究分担者の未使用額も同様の目的で使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Expression of tumor suppressor REIC/Dkk-3 by a newly improved adenovirus vector with insertion of an hTERT promoter at the 3’-side of the transgene. (2017)
  • 著者名/発表者名: Putranto, E. W., Kinoshita, R., Watanabe, M., Sadahira, T., Murata, H., Yamamoto, K., Futami, J., Kataoka, K., Inoue, Y., Ruma, I. M. W., Sumardika, I. W., Youyi, C., Kubo, M., Sakaguchi, Y., Saito, K., Nasu, Y., Kumon, H., Huh, N. H., Sakaguchi, M.
  • 雑誌名: Oncol. Lett. 巻: 14 ページ: 1041－1048
  • DOI: 10.3892/ol.2017.6201
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Adsorption of Staphylococcus viruses S13´ and S24-1 on Staphylococcus aureus strains with different glycosidic linkage patterns of wall teichoic acids. (2017)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama, J., Taniguchi, M., Kurokawa, K., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Shimakura, H., Sakaguchi, Y., Murakami, H., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • 雑誌名: J. Gen. Virol. 巻: 98(8) ページ: 2171－2180
  • DOI: 10.1099/jgv.0.000865
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cellular entry of Clostridium perfringens iota-toxin and Clostridium botulinum C2 toxin. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takehara, M., Takagishi, T., Seike, S., Oda, M., Sakaguchi, Y., Hisatsune, J., Ochi, S., Kobayashi, K., Nagahama, M.
  • 雑誌名: Toxins 巻: 9(8) ページ: 247
  • DOI: 10.3390/toxins9080247
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 黄色ブドウ球菌における大型ファージの普遍形質導入の研究 (2018)
  • 著者名/発表者名: 中森洋佑、内山淳平、村上裕信、阪口義彦、水上圭二郎、内山伊代、阪口雅弘
  • 学会等名: 第2回獣医微生物学フォーラム
• [学会発表] Analysis of botulinum neurotoxin-converting phages in Clostridium botulinum types C and D (2018)
  • 著者名/発表者名: Sakaguchi, Y., Uchiyama, J., Ogura, Y., Gotoh, K., Yamamoto, Y., Matsuzaki, S., Yamaguchi, A., Hayashi, T., Oguma, K., Hayashi, S.
  • 学会等名: The 91st Annual Meeting of Japanese Society for Bacterioology
• [学会発表] 関東の医療施設で分離されたAcinetobacter baumanniiの分子疫学的解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山口明日美、阪口義彦、松井真理、小林秀丈、内山淳平、松井秀仁、花木秀明、林 俊治
  • 学会等名: 第91回日本細菌学会総会
• [学会発表] Acinetobacter baumanniiの同定方法の比較検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山口明日美、阪口義彦、松井真理、内山淳平、松井秀仁、花木秀明、小林秀丈、林 俊治
  • 学会等名: 第91回日本細菌学会総会
• [学会発表] C型ボツリヌス毒素を支配するバクテリオファージの解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 阪口義彦
  • 学会等名: 第8回北里感染症教育フォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] 関東の医療施設で分離されたAcinetobacter baumanniiの分子疫学的解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山口明日美、阪口義彦、小山内洋子、小林秀丈、松井真理、内山淳平、松井秀仁、花木秀明、林俊治
  • 学会等名: 第100回日本細菌学会関東支部総会
• [学会発表] Acinetobacter baumanniiの同定方法の比較検討 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山口明日美、阪口義彦、小山内洋子、松井秀仁、花木秀明、松井真理、内山淳平、林俊治
  • 学会等名: 平成29年度（第54回）日臨技 関甲信支部・首都圏支部医学検査学会
• [学会発表] Acinetobacter baumanniiのresistance islandの遺伝子解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山口明日美、阪口義彦、小山内洋子、松井真理、小林秀丈、内山淳平、松井秀仁、花木秀明、林俊治
  • 学会等名: 第29回日本臨床微生物学会総会・学術集会
• [学会発表] Analysis of adsorption of phages, S13' and S24-1, belonging to the family Podoviridae genus P68virus, using Staphylococcus aureus strains with different glycosidic linkage patterns of wall teichoic acids (2017)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama, J., Taniguchi, M., Kurokawa, K., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Shimakura, H., Sakaguchi, Y., Murakami, H., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • 学会等名: International Union of Microbiological Societies (IUMS)
  • 国際学会
• [学会発表] Adsorption of Staphylococcus viruses S13' and S24-1 on Staphylococcus aureus strains with different glycosidic linkage patterns of wall teichoic acids (2017)
  • 著者名/発表者名: Uchiyama, J., Taniguchi, M., Kurokawa, K., Takemura-Uchiyama, I., Ujihara, T., Shimakura, H., Sakaguchi, Y., Murakami, H., Sakaguchi, M., Matsuzaki, S.
  • 学会等名: The 16th Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • 国際学会