| 研究課題/領域番号 |
16K08790
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
石島 早苗 帝京大学, 医真菌研究センター, 講師 (80147214)
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| 研究分担者 |
安部 茂 帝京大学, 医療技術学部, 教授 (10125974)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | Candida albicans / アドヘシン / 消化管カンジダ症マウスモデル / Leaky Gut / タンパク分解酵素 / 悪化因子 |
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| 研究実績の概要 |
抗生物質による菌交代症や抗癌剤治療による免疫力の低下は内因性の真菌症、特に、カンジダ症を増加させる。本研究の「腸管上皮からの侵入・播種する微細機構」は感染増悪の初期段階で菌糸形発育した菌が宿主の組織に侵入・播種する機構を解明し、新たな悪化因子の同定や抗真菌薬開発に繋げることを目的としている。
今年度は、
(1)腸管から侵入・播種する微細機構を解明するため、GFP発現プラスミドpGEM-GFP-URA3-GFPを用いて解析を行った。消化管カンジダ症マウスモデルでの感染状態の解析のため、マウスに常在性の菌との差別化を行い、新たに感染したGFP-カンジダの感染実験を開始した。
(2)また、既に作成した消化管カンジダ症マウスモデルでのLeaky Gut状態を感染直後から時間経過とともに詳細に再検討した。感染48時間、72時間後では、各臓器からカンジダRNAを損傷が少ない状態で単離する方法を検討し、実際に胃からRNAを得た。この胃からの菌と試験管内で酵母形、菌糸形で培養した菌のRNAからqRT-PCRを行い、悪化因子に上げられているアドヘシン及びタンパク分解酵素、悪化因子関連の転写因子などに発現状態の差が検出された。
(3)これらの実験に関して、当研究センターでこれまで使用してきたTIMM1768株を用いて研究を行っているが、海外での論文報告との比較検討を行うために、カンジダ菌の全ゲノム配列が報告されているSC5314株を新たに購入し、比較検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年来、消化管カンジダ症マウスモデルに感染状態にあるカンジダ菌からRNAを効率よく単離する方法を検討してきたが、RNAの保存性の良い試薬を用いて、2段階の独特の破砕法で問題解決することができた。カンジダ菌特異的な18SrRNAの遺伝子配列を内部標準として、qRT-PCRを実施し、マウスモデルの組織内に感染しているカンジダ菌と、in vitroでの遺伝子発現との差を検討することができた。また、形態学的には、GFPの発現しているカンジダ菌を作製し、マウスの常在菌との差別化を検討中である。以上の点から、本年度の論文化には至らなかったものの、本研究課題に関する研究の進展が得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまで、感染マウスモデルから、カンジダ菌由来のRNAを効率よく、損傷を少なく単離する方法を検討した結果、宿主のマウス由来RNAを選択的に取り除き、カンジダ菌のRNAを得ることができた。このRNAを用いて、これまで、qRT-PCR法で悪化因子と思われる遺伝子について検討してきたが、次年度の最終年度で、RNA-seq法を用いて、消化管に感染したカンジダ菌で発現している遺伝子を網羅的に検索する予定である。また、現在交渉中であるが、遺伝子破壊株のライブラリーを入手して、RNA-seqで得られた、特徴的な悪化因子の破壊株でのマウス実験を実施したいと考えている。これにより、消化管から侵入・播種するのに必要な新規悪化因子を解明することができると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究に必要な、当該年度使用予定のカンジダ菌のライブラリー購入が海外の業者とのMTA手続きなどの過程で遅くなり、次年度に持ち越しているため。現在、手続き中である。
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