| 研究課題/領域番号 |
16K08791
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| 研究機関 | 鈴鹿医療科学大学 |
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研究代表者 |
中山 浩伸 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (40369989)
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| 研究分担者 |
森田 明広 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (20382228)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 鉄欠乏ストレス / 真菌感染症 / カンジダ / 病原性発現 / 標的分子 |
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| 研究実績の概要 |
真菌が宿主体内でおこる鉄欠乏に適応することは、宿主体内での増殖、病原性の発現に重要となる。本研究は、病原酵母カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）を用いて、鉄欠乏ストレスの応答因子を同定し、それらの機能を宿主体内での重要性を含めて明らかにすることから、鉄欠乏応答システムの全容を解明すること、そして、そこで得られた知見をもとに抗真菌薬の標的分子の選出や化合物スクリーニングを行うことで、真菌感染症の治療戦略を創製することを目標とした。
平成29年度は、28年度の実験結果をもとに、培地中の鉄濃度が低いと鉄で増殖できない株を選抜、それらの株をカイコに感染させ、病原性低下の有無を確認した（Med Mycol J. 2017 58:E79-86）。また、鉄欠乏時におこるミトコンドリア分解で重要な役割をするATG32についての機能解析を進め、ATG32が細胞内鉄濃度の恒常性維持に寄与していることを明らかにした（第 61 回日本医真菌学会総会）。さらに、鉄欠乏時にアゾール系抗真菌薬がカンジダ・グラブラータに効きにくくなることを明らかにしたりした(第91回日本細菌学会総会）。
このほか、真菌の薬剤排出ポンプ阻害活性を持つことが明らかとなったモノアミンオキシターゼA (MAO-A)阻害薬は、ポンプ阻害活性以外の機能により抗真菌薬の感受性をあげることを示した（PLoS One. 201712:e0180990：現在、MAO-A阻害薬の添加と細胞内の鉄濃度との関連を調べている）。
これらの結果は、真菌の鉄欠乏ストレスの応答機構の解明に大きく貢献する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度は、１）鉄代謝調節に関わっていると考えている転写因子UPC2Aが支配する遺伝子群の同定とそれら因子の病原性への関与の有無、２）同定因子の発現時期の解析と細胞内局在の同定、３）変異株を用いた細胞レベルでのスクリーニング系の確立を計画した。
1)については、候補遺伝子の選別が終了（約20遺伝子）し、ほぼ変異株作製が終了した。今回は、鉄代謝調節に着目しているので、これらの変異株のうち、培地中の鉄濃度が低いと増殖できない株を選抜し、カイコ感染モデルを用いて病原性への関与の有無を確認中である。２）に関しては、該当因子に3x HAおよび3x Mycを導入した株を作製中であるが、発現時期の解析や細胞内局在の同定までには至っていない。3)に関しては、スクリーニングに用いる変異株の選定が手間取っており、計画した項目で一番進行が遅れている。
また、培地中の鉄濃度が低いと増殖できない変異株のうち、形態変化を示した株（キナーゼをコードする遺伝子を欠損した株およびTet-OFF株：発現制御株）については、マウス、カイコ用いた病原性への関与の有無の実験のほか、薬剤感受性や細胞壁合成への影響など詳細な解析を行った（第61回日本医真菌学会総会）。
このように、計画した項目について実験を実施しているものの、細胞レベルでのスクリーニング系の確立など十分に実施できていない項目があるため、今後、これら完了していない項目について優先的に進めていく予定である。
以上をまとめ、本研究課題全般として、やや遅れていると認識している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、前年度に実験が完了していない、同定因子の発現時期の解析と細胞内局在の同定を1)のように続ける。また、細胞レベルでのスクリーニング系の確立については2）のように、鉄欠乏応答システムに関与する転写因子の同定については３）のように進める。さらに、新たに同定した因子の病原性への関与をカイコおよびマウスモデルを用いて検討し、鉄欠乏応答システムの全容の解明や感染成立を防ぐための標的分子の提案、抗真菌活性を有する化合物の選出につなげる。
１）該当因子に3x HAおよび3x Mycを導入した株を作製する。次に上記の発現解析の結果をもとに各因子の発現時期まで培養し、超遠心により分画後、抗HA抗体および抗Myc抗体を用いたウエスタン解析で、細胞局在を調べる。
２）本研究で同定した遺伝子のプロモーター領域（上流1,000bp）にレポーター遺伝子（ルシフェレース）をつないだコンストラクトを導入した株を用い、低鉄濃度培地で化合物ライブラリーをスクリーニングし、レポーター活性のなくなる化合物を探索する。
３）上記レポーター遺伝子のプロモーター解析を行う。100 bp単位で欠損させたレポーターライブラリーを準備し、レポーター活性の変化する領域を探索することから、転写調節領域を同定する。次に、鉄欠乏培地で培養した野生株の抽出物と転写領域のDNAを用いて、ゲルシフトアッセイを行い、シフトしたバンドからタンパク質を抽出して質量分析を行う。うまく行かない場合は、転写調節領域のDNAを用いて、鉄欠乏培地で培養した野生株の抽出物からアフィニティ精製、質量分析を行い、結合したタンパクを同定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
欠損株の経時的な遺伝子の発現解析やマイクロアレイに使用するRNAの調整が年度内に終了せず、購入予定の試薬の一部（RNA調整試薬）を購入しなかった。そのため、次年度使用額が生じた。
繰り越し分は、物品費（RNAの調整試薬の購入）として使用する。また、次年度の物品費として、変異株等の作製時に行う遺伝子操作実験や鉄欠乏に応答するシグナル伝達経路に関わる因子の選定のために行うmRNAシークエンスによる発現解析、細胞内局在を調べる生化学的解析などに必要な試薬類および消耗品を購入する。また、感染実験に使用するカイコ（600 匹）、マウス（Balb/c：100頭）も物品費として購入する計画である。これらを合わせての使用額を700,000円と計画した。また、国内外の学会発表、研究会や研究打ち合わせに必要な旅費、宿泊費、日当を“国内旅費”として300,000円を使用する計画である。その他、論文を投稿するための研究成果投稿料と論文別冊作製に必要な経費として100,000円を使用する計画である。
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