| 研究課題/領域番号 |
16K08792
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| 研究機関 | 帝塚山大学 |
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研究代表者 |
藤原 永年 帝塚山大学, 現代生活学部, 教授 (80326256)
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| 研究分担者 |
前田 伸司 北海道薬科大学, 薬学部, 教授 (50250212)
綾田 稔 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (90222702)
中 崇 帝塚山大学, 現代生活学部, 准教授 (40426599)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 非結核性抗酸菌症 / glycopeptidolipid |
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| 研究実績の概要 |
我々は、糖ペプチド脂質抗原glycopeptidolipide (GPL) の欠失によりM. smegmatis J15cs株が細胞内で長期生存できることを分子レベルで解明・報告した。細胞内寄生性菌で重篤な呼吸器感染症MAC症の主要起因菌であるMAC菌は血清型特異GPLを発現している。本研究では、MAC菌の感染宿主内での長期生存、感染性・病原性の発揮がGPLの存否と連関していることを、J15cs株での知見を応用して証明する。本年度は、J15cs株で変異により結果としてGPL欠損に導いているGPL生合成遺伝子mps1を破壊してGPL欠損MAC菌を作製することを試みた。まず、全ゲノム解析が実施されているMycobacterium avium 104株のmps1遺伝子に相当する部位をハイグロマイシン (Hyg)、カナマイシン (KM) 耐性遺伝子で置き換えることを試みた。pTA2ベクターにPCRで増幅させたmps1遺伝子10.2kbpの一部4.4kbpを挿入した。mps1遺伝子中のPshA1, Sph1サイトを利用してHyg, KM耐性遺伝子を連結し、mps1 (KM-R/Hyg-R) -pTA2プラスミドを構築した。本プラスミドを用いてM. avium 104株を形質転換したところ、Hyg, KMに耐性をもつクローン株が得られた。
pTA2ベクターは抗酸菌のレプリケーションオリジンが存在しないため、単独で増幅することはなく、プラスミドがゲノムに入ってKM, Hyg耐性を維持していると考えられた。得られたクローン株のGPL発現について今後評価していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
変異遺伝子として利用するmps1遺伝子は10.2kbと長く、分子生物学的な手法の応用に手間取ったため、本来申請時に提案した計画は少し遅れ気味である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の最終目標は、MAC菌の感染宿主内での長期生存、感染性・病原性の発揮がGPLの存否と連関していることを証明することである。本年度は、GPL生合成遺伝子であるmps1遺伝子の欠損MAC菌の取得に注力した。想定通りの欠損株かどうかをGPL発現の検討から検証する。GPL欠損株の取得が本研究の第一段階であり、これをクリアすれば期限内にGPLに関連した宿主応答を確実に検証できると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
現在までの進捗状況の項で述べたように、当初の計画から少し遅れているため、今年度に購入予定であった備品、消耗品を次年度に繰り越す措置をした。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度に計画していたGPL表現型の検討に必要な超音波破砕機、消耗品購入等は次年度に繰り越して利用する予定である。
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