研究課題
劇症型溶血性レンサ球菌感染症（STSS）は、患者の約30-50%が死亡する極めて致死率の高い全身性感染症である。B群レンサ球菌によるSTSSは、日本において、その症例数が5年前と比較して10倍以上に増加している。しかしながら、STSSを引き起こすB群レンサ球菌について世界を含めてほとんど研究されていない。B群レンサ球菌によるSTSSにおいて、菌がどのように変化したか調べることを目的とする。8株中少なくとも5株のSTSS株で、特定のタンパク質の分泌がみられたが、膣由来株6株調べたところこのタンパク質の分泌はみられなかった。このことから、STSS株と膣分離株との間に遺伝的差異があると考えた。その違いを見出すため、STSS株の中から目的の分泌タンパクが見られた2株を選び、ゲノムDNAを抽出した。同時に比較するコントロールとして、膣由来株中から1株を選び、ゲノムDNAを抽出した。これらのゲノムDNAを用い、一塩基多型解析（SNPs解析）を行った。STSS株2株で変異が見られ、膣由来株で変異が見られない遺伝子を抽出し、原因遺伝子の候補とした。STSS株で変異のあった遺伝子が、目的のタンパク質の分泌に影響を与えているか調べるため、STSS株に膣由来株のintactの遺伝子を持つプラスミドを導入した。導入した株を培養し、分泌タンパク質を抽出した。これをSDS-PAGEで分離し、STSS株でみられた分泌の上昇のあったタンパク質の量を確認した結果、病原遺伝子の発現が膣由来株と同じレベルになったものが1つ存在した。選択した遺伝子の変異株を作製した。膣由来株がもつ目的遺伝子の破壊株を作製し、分泌タンパク質を抽出した。これをSDS-PAGEで分離し、STSS株でみられた目的の分泌タンパク質の増加があるか確認した結果、目的のタンパク質の増加が見られた。
2: おおむね順調に進展している
申請書で記載した事項のことが行われており、結果も当初の予定通り出ているから。
同定した原因遺伝子について、STSS株においてどれくらいの頻度で変異がみられるか調べるため、STSSを引き起こした様々な血清型のB群レンサ球菌50株について原因遺伝子の塩基配列を決定する。塩基配列を決定したのち、アミノ酸配列に翻訳して変異領域のマップを作製する。原因遺伝子の変異によりin vivoで病原性に影響を与えるか調べるため、マウスをもちいた動物実験を行う。発現の上昇がみられたタンパク質について、SDS-PAGEにより得られたゲル断片からタンパク質を同定する。ゲノムワイドな遺伝子発現制御解析に加え、新規の病原性遺伝子を検索するため、STSS株、膣由来株、膣由来株の原因遺伝子を変異させた株からRNAを抽出し、マイクロアレイあるいはRNA-seqを行う。病原性に関与する遺伝子を検索するため、原因遺伝子に変異のみられるSTSS株で発現の上昇がみられ、ホモロジーサーチやモチーフ検索で膜タンパク質あるいは分泌タンパク質をコードしていると推測される遺伝子を選択する。膜タンパク質、あるいは、分泌タンパク質と推測された機能未知のものについて、遺伝子破壊株を作製する。作製した破壊株を用いて、マウスを用いた動物実験を行い、病原性に関与するものを検索する。
年度末納品等にかかる支払いが平成29年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成28年度分についてはほぼ使用済みである。
上記のとおり。
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Scientific Reports
巻: 6 ページ: 28761
10.1038/srep28761
