E型肝炎ウイルスの感染初期過程に関与する宿主因子の同定と機能解析

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08817
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 長嶋 茂雄 自治医科大学, 医学部, 講師 (60433116)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: E型肝炎ウイルス / 感染初期過程 / 受容体 / 感染感受性 / エクソソーム / エンベロープ

研究実績の概要

E型肝炎ウイルス (HEV) は胆汁中や糞便中のウイルス粒子の物理化学的性状からノンエンベロープウイルスに分類されている。一方で、血液中や培養上清中に放出された粒子は細胞由来の脂質膜に覆われている。これらの形態の異なるHEV粒子は共に培養細胞への感染性を有しているが、それぞれが利用する感染受容体については明らかとなっていない。
本年度は、膜に覆われたHEV粒子の性状を詳細に解析した。その結果、HEV感染細胞に由来する培養上清のエクソソーム分画には、脂質膜に覆われた感染性を有するHEV粒子が存在し、粒子表面の膜成分はエクソソームと共通の抗原性を有していることを見出した。また電子顕微鏡解析により、これらのHEV粒子は個々のキャプシドが脂質膜に覆われた形態を取っていることを明らかにした。以上の結果から、膜に覆われたHEV粒子の外側にはORF2蛋白質は露出しておらず、粒子形態の違いにより利用する受容体が異なることが示唆された。本研究成果は、Journal of Virology (Nagashima et al. Characterization of the quasi-enveloped hepatitis E virus particles released by the cellular exosomal pathway. 91:e00822-17,2017) に掲載された。
また、昨年度に同定した膜に覆われたHEV粒子の受容体候補蛋白質をCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウトした細胞を作製し、HEVの増殖能を調査した結果、増殖効率は明らかに低下し、低いウイルス感染価での接種実験ではHEVの増殖が完全に抑制された。さらに、受容体候補蛋白質と同じ蛋白質ファミリーに属する別の蛋白質が、膜に覆われていないHEV粒子の感染初期過程に関与していることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究計画のうち、HEV感染の初期過程に関与する受容体の同定に向けては、昨年度に同定した膜に覆われたHEVの受容体候補と考えられる蛋白質の機能解析を進めた。CRISPR/Cas9システムを用いて、受容体候補蛋白質をノックアウトした細胞を作製し、膜に覆われたHEVを接種した結果、HEVの増殖が阻害された。また、膜に覆われたHEVに感受性を示さない細胞株を解析し、これらの細胞株では受容体候補蛋白質が発現されていないことを確認した。これにより、受容体候補蛋白質の安定発現細胞の作製が可能となった。
感染感受性を規定する宿主因子の探索についても、膜に覆われたHEVの感染初期過程にタイトジャンクションが関与していることが明らかとなり、重要な働きをするタイトジャンクション蛋白質を同定した。さらに、膜に覆われていないHEVの感染初期に必要な蛋白質を同定することができた。この蛋白質は、膜に覆われたHEVの受容体候補蛋白質と同じ蛋白質ファミリーに属するものであり、膜に覆われていないHEVの受容体としての機能を有することが示唆された。
以上のように、次年度の研究を計画通りに実施し進展させることが可能となっており、本年度の研究は当初の計画通り進捗していると判断された。

今後の研究の推進方策

今後は、膜に覆われたHEVの受容体候補蛋白質を発現していない細胞に、候補蛋白質を発現させた安定発現細胞を作製する予定である。これらの細胞を用いて、HEVの吸着、細胞内侵入、増殖能を解析し、感染感受性が付与されるか否かを調べる。非感受性細胞を用いた感染付与実験が困難であった場合は、ノックアウト細胞を用いて安定発現細胞を作製し、解析を進める。
膜に覆われていないHEVの感染初期過程に関与していることが明らかとなった蛋白質についてもノックアウト細胞を作製し、HEVの増殖能への影響を調べる予定である。さらに、受容体としての機能を明らかにするために、同定された蛋白質に対する特異抗体を用いてHEV感染阻害効果の解析を行う計画である。
以上の解析により、粒子形態の違いにより利用する感染受容体や宿主因子が異なることを提示したいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] An analysis of two open reading frames (ORF3 and ORF4) of rat hepatitis E virus genome using its infectious cDNA clones with mutations in ORF3 or ORF4 (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanggis、Kobayashi Tominari、Takahashi Masaharu、Jirintai Suljid、Nishizawa Tsutomu、Nagashima Shigeo、Nishiyama Takashi、Kunita Satoshi、Hayama Emiko、Tanaka Takeshi、Mulyanto、Okamoto Hiroaki
  • 雑誌名: Virus Research 巻: 249 ページ: 16～30
  • DOI: 10.1016/j.virusres.2018.02.014
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Hepatitis E virus subtype 3f strains isolated from Japanese hepatitis patients with no history of travel to endemic areas ? The origin analyzed by molecular evolution (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakano Tatsunori、Takahashi Masaharu、Takahashi Kazuaki、Nagashima Shigeo、Suzuki Yusuke、Nishigaki Yoichi、Tomita Eiichi、Okano Hiroshi、Oya Yumi、Shiraki Katsuya、Takase Kojiro、Sugimoto Kazushi、Koyama Junichi、Mizuo Hitoshi、Ikezawa Kazuto、Aikawa Tatsuya、Arai Masahiro、Okamoto Hiroaki
  • 雑誌名: Virology 巻: 513 ページ: 146～152
  • DOI: 10.1016/j.virol.2017.08.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Full-length genomic sequence analysis of new subtype 3k hepatitis E virus isolates with 99.97% nucleotide identity obtained from two consecutive acute hepatitis patients in a city in northeast Japan (2017)
  • 著者名/発表者名: Miura Masahito、Inoue Jun、Tsuruoka Mio、Nishizawa Tsutomu、Nagashima Shigeo、Takahashi Masaharu、Shimosegawa Tooru、Okamoto Hiroaki
  • 雑誌名: Journal of Medical Virology 巻: 89 ページ: 1116～1120
  • DOI: 10.1002/jmv.24743
  • 査読あり
• [雑誌論文] Autochthonous sporadic acute hepatitis E caused by two distinct subgenotype 3b hepatitis E virus strains with only 90% nucleotide identity (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Yasuko、Takagi Hitoshi、Suzuki Yuhei、Maruhashi Kyoko、Kosone Takashi、Kakizaki Satoru、Sato Ken、Yamada Masanobu、Nagashima Shigeo、Takahashi Masaharu、Okamoto Hiroaki
  • 雑誌名: Clinical Journal of Gastroenterology 巻: 10 ページ: 168～173
  • DOI: 10.1007/s12328-017-0718-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Distinct changing profiles of hepatitis A and E virus infection among patients with acute hepatitis in Mongolia: The first report of the full genome sequence of a novel genotype 1 hepatitis E virus strain (2017)
  • 著者名/発表者名: Tsatsralt-Od Bira、Primadharsini Putu Prathiwi、Nishizawa Tsutomu、Ohnishi Hiroshi、Nagashima Shigeo、Takahashi Masaharu、Jirintai Suljid、Nyamkhuu Dulmaa、Okamoto Hiroaki
  • 雑誌名: Journal of Medical Virology 巻: 90 ページ: 84～92
  • DOI: 10.1002/jmv.24907
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Full-length genome of a novel genotype 3 hepatitis E virus strain obtained from domestic pigs in Japan (2017)
  • 著者名/発表者名: Primadharsini PP, Miyake M, Kunita S, Nishizawa T, Takahashi M, Nagashima S, Tanggis, Ohnishi H, Kobayashi T, Nishiyama T, Jirintai S, Okamoto H
  • 雑誌名: Virus Research 巻: 240 ページ: 147-153
  • DOI: 10.1016/j.virusres.2017.08.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of the Quasi-Enveloped Hepatitis E Virus Particles Released by the Cellular Exosomal Pathway (2017)
  • 著者名/発表者名: Nagashima Shigeo、Takahashi Masaharu、Kobayashi Tominari、Nishizawa Tsutomu、Nishiyama Takashi、Primadharsini Putu Prathiwi、Okamoto Hiroaki、Tanggis
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 91 ページ: e00822～17
  • DOI: 10.1128/JVI.00822-17
  • 査読あり
• [雑誌論文] Full-length genomic sequences of new subtype 1g hepatitis E virus strains obtained from four patients with imported or autochthonous acute hepatitis E in Japan (2017)
  • 著者名/発表者名: Nishizawa Tsutomu、Primadharsini Putu Prathiwi、Namikawa Masashi、Yamazaki Yuichi、Uraki Satoko、Okano Hiroshi、Horiike Shinichiro、Nakano Tatsunori、Takaki Shintaro、Kawakami Manri、Nagashima Shigeo、Takahashi Masaharu、Okamoto Hiroaki
  • 雑誌名: Infection, Genetics and Evolution 巻: 55 ページ: 343～349
  • DOI: 10.1016/j.meegid.2017.10.007
  • 査読あり
• [学会発表] Cathepsin L is required for entry step of hepatitis E virus (2017)
  • 著者名/発表者名: Shigeo Nagashima, Masaharu Takahashi, Tominari Kobayashi, Tanggis, Tsutomu Nishizawa, Takashi Nishiyama, Putu Prathiwi Primadharsini, Hiroaki Okamoto
  • 学会等名: International Union of Microbiological Societies 2017 Singapore
  • 国際学会
• [学会発表] Capsids of hepatitis E virus particles are individually covered by lipid membranes (2017)
  • 著者名/発表者名: Shigeo Nagashima, Masaharu Takahashi, Tominari Kobayashi, Tanggis, Putu Prathiwi Primadharsini, Takashi Nishiyama, Tsutomu Nishizawa, Hiroaki Okamoto
  • 学会等名: 第65回日本ウイルス学会学術集会 大阪
• [備考] 自治医科大学医学部 感染・免疫学講座ウイルス学部門 ホームページ
  • URL: http://www.jichi.ac.jp/virology/