研究課題
Toll like receptor (TLR) 7およびTLR8 はウイルス由来一本鎖RNA（ssRNA）を認識し、強力な抗ウイルス応答を誘導する。これまでに我々は、TLR7/8がssRNA自体ではなく、ssRNAの分解産物であるヌクレオシドとオリゴヌクレオチドの両者を同時に認識して免疫応答を誘導するという知見を見出してきた。実際、ssRNAとグアノシン、またはウリジンを加えて免疫細胞を刺激することで、TLR7とTLR8はそれぞれ相乗的に活性化する。しかし、免疫細胞に発現するTLR7/8がssRNAの分解産物であるグアノシンやウリジンを実際に結合するのを示すのは難しい。そこで本研究では、RNA分解に関わるRNaseや核酸トランスポーターがTLR7/8によるssRNA応答に関与することを示し、ssRNA分解が細胞内TLR7/8応答に必須であることを実証する。平成28年度、TLR7のssRNA応答に関与する核酸代謝関連分子の検証をin vitroで行った結果、RNaseT2やSLC29A3がTLR7の制御因子として見出した。また、RNaseT2やSLC29A3のノックアウトマウスも作製したところ、これらマウスにおいて顕著なマクロファージの蓄積（Histiocytosis）が認められた。平成29年度はこれらノックアウトマウスをTLR7ノックアウトマウスと交配し、得られたフェノタイプがTLR7依存的か否かの検証を行った。その結果、SLC29A3ノックアウトマウスにおけるHistiocytosisはTLR7依存的である可能性が非常に高かった。一方、RNaseT2ノックアウトマウスにおける病態はTLR7非依存的であった。現在、RNaseT2ノックアウトマウスにおいて活性化し得る核酸認識センサーの同定を進めている。
2: おおむね順調に進展している
当初の計画通り、TLR7によるssRNA応答に核酸代謝関連遺伝子が関与することを証明することができた。また、ノックアウト細胞を用いることでSLC29A3とRNaseT2以外のヌクレオシドトランスポーターがTLR7応答に関与することも見出している。以下、予定していた研究内容の達成度の詳細を記載する。1.代謝関連遺伝子ノックアウト細胞の作製 ： 平成28年度にノックアウト細胞を用い、ヌクレオシドトランスポーターであるSLC29A3およびRNaseT2がTLR7応答に関与することを見出した。平成29年度には、SLC29A3以外のヌクレオシドトランスポーターが一部のTLR7応答を制御することも見出しており、平成30年度にはそれら分子のノックアウトマウスを作製して解析する予定である。2. CRISPR/CASシステムを利用したノックアウトライブラリースクリーニング : 平成28年度にBa/F3レポーター細胞を用いたノックアウトライブラリースクリーニングを行ったが、ssRNA応答に関与する新規分子は得られなかった。現在、ssRNA応答性が高いマクロファージ細胞株のJ774細胞を用いたノックアウトライブラリースクリーニングを進めている。3. 代謝関連遺伝子ノックアウトマウスの作製および解析： RNaseT2およびSLC29A3ノックアウトマウスの作製を行い、これらノックアウトマウスにおいてHistiocytosisが生じることを示した。特にH症候群モデルであるSLC29A3ノックアウトマウスの病態はTLR7依存的あることが判明してきており、今後はH症候群においてTLR7が治療ターゲットとなるか否かを検証していく。また、in vitroにおいてTLR7応答に関与していることが判明したヌクレオシドトランスポーター2遺伝子に関してもノックアウトマウスを作製中である。
これまでに得られた結果より、ssRNAによるTLR7/8の活性化において核酸代謝関連遺伝子が関与することが明らかとなった。特に、ヒト疾患であるH症候群のモデルとしても知られるSLC29A3ノックアウトマウスの病態がTLR7依存的であることが明らかとなってきたことより、今後はH症候群の治療においてTLR7がターゲットとなり得るかを中心に検証を進めていく。一方、RNaseT2におけるHistiocytosisは予想外にTLR7非依存的に引き起こされていた。RNaseT2はssRNA分解酵素であることからTLR7以外のssRNAセンサーが活性化された結果であると考えられる。平成30年度はこのRNaseT2ノックアウトマウスにおけるフェノタイプの原因遺伝子の同定を目指す。また、SLC29A3とRNaseT2以外にもin vitroの系を用いてTLR7応答を制御するヌクレオシドトランスポーターを2種類見出しており、これら遺伝子のノックアウトマウスを作製・解析することでTLR7応答におけるヌクレオシド代謝の意義の解明を更に進める。
予定していたノックアウトマウスの作製費用が足りなくなった為、次年度分と合わせて使用するため。
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