関節リウマチの自己抗体上の糖鎖改変による機能制御と新規治療戦略

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08829
• 研究機関: 中部大学
• 研究代表者: 大海 雄介 中部大学, 生命健康科学部, 助手 (10584758)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 関節リウマチ / IgG / シアル酸 / 糖鎖 / 自己抗体

研究実績の概要

RAにおけるシアル酸付加による自己抗体機能の変化を明らかにするため、RAの自己抗体産生ハイブリドーマを用いて人工的にシアル酸を付加したACC4抗体(ACPA) & M2139抗体(抗II型コラーゲン抗体)を作成し、これらシアル酸付加自己抗体をDBA1マウスに事前投与した結果、らシアル酸付加自己抗体投与したマウスではCIAを抑制することができた。また、シアル酸付加したirrelevant IgGではCIAを抑制することはできなった。これによりシアル酸付加自己抗体がRAの抑制に寄与している事を示唆された。これらの成果は2016年にNature communicationsに掲載された。
また、ACC4/M2139 Sia(+)に対するcontrol IgGを作成するため、ACC4の抗原認識部位の一部をCRISPR/Cas9システムによって欠失させて、自己抗原に反応しない全く同じIgGを産生するhybridomaを作製した。
さらに、Fc領域にシアル酸を付加した事による抗原親和性の変化につき検討するため、ACC4/M2139それぞれの抗原である環状シトルリン化ペプチド(CCP)とII型コラーゲン(Col II)に対する反応性を検討した結果、シアル酸の有無による抗原への親和性の変化は確認できなかった。
また、Fc領域へのシアル酸の付加によるIgG機能の変化を検討するため、単球系細胞の活性化を検討した。ACC4/M2139のそれぞれの抗原(CCP/Col II)をcoatし、そこにACC4及び M2139 Sia(+)/(-)を加え、洗浄後、DBA1マウス脾臓から回収したPBMCを反応させて、発現するサイトカイン等の炎症性因子の遺伝子発現をreal time RT-PCRで確認したところ、シアル酸付加抗体で炎症性サイトカインの発現が減少した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに、RAにおけるIgG上のシアル酸の機能を解析し、さらには、シアル酸付加自己抗体がRAの抑制に寄与している事を明らかにしてきた。また、これらの成果はNature Communicationsに掲載された。これは大きな成果であり、現在まで研究はとても順調に進展している。一方、シアル酸付加によるFc機能の検討はまだ不明な点が多く、今後の課題になっている。

今後の研究の推進方策

今後は上記のように、またシアル酸付加抗体へのPBMCの反応性の詳細を明らかにするため、ELISAによるサイトカインの発現検討し、さらには、どの免疫細胞がシアル酸付加抗体による影響を受けるか検討を進め、自己抗体上のシアル酸付加によるRAの抑制の分子メカニズムを明らかにしていく。
また、現在、CRISPR/Cas9システムによって作成したACC4に対するcontrol IgG にST6Gal1とB4GalT1遺伝子を導入して、シアル酸を大量に付加したcontrol IgG Sia(+)を作成中である。これにより、正確なcontrol IgGを置くことにより自己抗体の抗原特異性に焦点化して検討することができる。
また、た、シアル酸付加IgGのin vivoでの影響を明らかにするため、活性型B細胞で限局的に発現するST6Gal1 とB4GalT1遺伝子の強制発現マウス(ST6Gal1LSL-Tg x B4GalT1LSL-Tg x AID-Creマウス)を作製予定である。

次年度使用額が生じた理由

RA抑制時における投与抗体の作用機序を検討するため、ACC4/M2139 Sia(+)を人工的にbiotinラベルしたが、biotinラベル化したACC4/M2139 Sia(+)の量が少なく、その他のラベルも含めて、条件を再検討している。

次年度使用額の使用計画

上記の計画に沿って、必要な消耗品の購入やマウスの維持費等にあてる。また、必要な研究打ち合わせ、学会発表等の費用としても使用したい。

研究成果

• [雑誌論文] Expression of B4GALNT1, an essential glycosyltransferase for the synthesis of complex gangliosides, suppresses BACE1 degradation and modulates APP processing. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tokiaki Yamaguchi, Yoshio Yamauchi, Keiko Furukawa, Yuhsuke Ohmi, Yuki Ohkawa, Qing Zhang, Tetsuya Okajima, Koichi Furukawa.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 30 ページ: -
  • DOI: 10.1038/srep34505.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Increased a-series gangliosides positively regulate leptin/Ob receptor-mediated signals in hypothalamus of GD3 synthase-deficient mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Shuting Ji, Yuki Ohkawa, Kyohei Tokizane, Yuhsuke Ohmi, Ryoichi Banno, Tetsuya Okajima, Hiroshi Kiyama, Koichi Furukawa, Keiko Furukawa.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 479 ページ: 453-460
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.09.077. Epub 2016 Sep 16.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neogenin defined as a GD3-associated molecule by enzyme-mediated activation of radical sources confers malignant properties via intra-cytoplasmic domain in melanoma cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kei Kaneko, Yuki Ohkawa, Noboru Hashimoto, Yuhsuke Ohmi, Norihiro Kotani, Koichi Honke, Mitsutaka Ogawa, Tetsuya Okajima, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 291 ページ: 16630-16643
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.708834. Epub 2016 Jun 10.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression analysis of 0-series gangliosides in human cancer cell lines with monoclonal antibodies generated using knockout mice of ganglioside synthase genes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Robiul Hasan Bhuiyan, Yuji Kondo, Tokiaki Yamaguchi, Noriyo Tokuda, Yuki Ohkawa, Noboru Hashimoto, Yuhsuke Ohmi, Yoshio Yamauchi, Keiko Furukawa, Tetsuya Okajima, Koichi Furukawa.
  • 雑誌名: Glycobiology. 巻: 26 ページ: 984-998
  • 査読あり
• [雑誌論文] A therapeutic trial of human melanomas with combined small interfering RNAs targeting adaptor molecules p130Cas and paxillin activated under expression of ganglioside GD3. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Makino, Kazunori Hamamura, Yoshifumi Takei, Robiul Hasan Bhuiyan, Yuki Ohkawa, Yuhsuke Ohmi, Hideyuki Nakashima, Keiko Furukawa, Koichi Furukawa.
  • 雑誌名: Biochim Biophys Acta. 巻: 1860 ページ: 1753-1763
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2016.04.005. Epub 2016 Apr 9.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sialylation converts arthritogenic IgG into inhibitors of collagen-induced arthritis. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yuhsuke Ohmi, Wataru Ise, Akira Harazono, Daisuke Takakura, Hidehiro Fukuyama, Yoshihiro Baba, Masashi Narazaki, Hirofumi Shoda, Nobunori Takahashi, Yuki Ohkawa, Keishi Fujio, Atsushi Kumanogoh, Kazuhiko Yamamoto, Nana Kawasaki, Tomohiro Kurosaki, Yoshimasa Takahashi, Koichi Furukawa et al.
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 7 ページ: -
  • DOI: 10.1038/ncomms11205.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 抗シトルリン化タンパク質抗体は関節炎病態にどのように関与しているか? (2016)
  • 著者名/発表者名: 大海雄介、古川鋼一
  • 雑誌名: 分子リウマチ治療 巻: 9 ページ: 12-17
  • 査読あり
• [学会発表] 関節リウマチ抗原特異的抗体上のシアル酸はII型コラーゲン誘導型関節炎を抑制する (2016)
  • 著者名/発表者名: 大海雄介、伊勢渉、原園景、高橋大輔、福山英啓、川崎ナナ、河原敏男、黒崎知博、高橋宜聖、古川鋼一
  • 学会等名: 第89回日本生化学会
  • 発表場所: 宮城県・仙台市 仙台国際センター
  • 年月日: 2016-09-27 – 2016-09-27
• [学会発表] 関節炎惹起性IgGのシアル酸修飾はコラーゲ ン誘発性関節炎の抑 制機能を付与する (2016)
  • 著者名/発表者名: 大海 雄介、伊勢 渉、原園 景、高倉 大輔、福山 英啓、 川崎 ナナ、河原 敏男、黒崎 知博、高橋 宜聖、古川 鋼一
  • 学会等名: 第35回日本糖質学会
  • 発表場所: 高知県・高知市 高知市文化プラザ
  • 年月日: 2016-09-01 – 2016-09-01
• [図書] 脳内環境辞典 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大海雄介、高橋良輔、小峯 起、高松芳樹、萬代研二、富田泰輔、山口賀章、木下彩栄、大倉正道、華山力成、三澤日出巳、富永真琴、平井宏和、五十嵐道弘、前川洋太、矢尾育子、野口 潤、碓井理夫、竹居光太郎、菅田浩司、他
  • 総ページ数: 160（38-39）
  • 出版者: 株式会社 メディカルドゥ