| 研究課題/領域番号 |
16K08849
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
植田 祥啓 関西医科大学, 医学部, 講師 (90533208)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 負の選択 / 制御T細胞 / 胸腺 / T細胞分化 |
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| 研究実績の概要 |
１)胸腺組織内の負の選択及の過程を可視化するためにOVA特異的TCRであるOT-2とCaspase3のFRETバイオセンサーであるSCAT3の二重トランスジェニックマウスから、CD4・CD8二重陽性（DP）細胞とCD4単陽性（SP）SP細胞をそれぞれフローサイトメトリーによりソーティングして胸腺スライスに導入し、抗原存在下で培養した。SCAT3はCFP/YFPの間にCaspase3の切断配列を含むセンサーで、常時Fretが誘導されるが、Caspase3によって切断されるとFretが起こらなくなる。結果、DP細胞は濃度に比例してFretの減少に伴うドナーCFPの輝度上昇が観察され、アポトーシスが検出された一方で、抗原濃度に関わらず、SP細胞は一定の低い頻度の細胞がアポトーシスが誘導されていた。さらに、2光子励起レーザー顕微鏡によって胸腺組織内のOT-II SCAT3由来SP胸腺細胞がアポトーシスする様子を観察した。その結果、非常に低頻度ではあるが抗原依存的に停止している細胞ではなく、移動している細胞においてFretの低下が観察された。
２）接着・動態制御分子Rap1シグナルの胸腺T細胞分化における役割を明らかにするために、T細胞依存的なRap1a/bの二重欠損マウスと1および下流のインテグリン活性化因子であるkindlin3のT細胞依存的な欠損マウスを作製し、胸腺におけるT細胞の分化を測定した。その結果、これらの欠損により、DP細胞の割合に対してCD69陽性のCD4SP細胞の割合、特にMHC classI陽性CD69陽性の第一段階の成熟T細胞の割合が低下することが明らかとなった。また、CD69陽性の低下はCD8SP細胞でより顕著であった。以上のことからRap1-kindlin3軸によるインタグリンの制御がCD4およびCD8細胞の分化または生存に重要である可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
胸腺スライスを用いた制御性T細胞の分化の系を確立することができ、SCAT3センサートランスジェニックマウスを用いて、胸腺スライスを用いた制御性T細胞の分化の系におけるアポトーシスの割合を検出し、イメージングすることが可能となった。
OT-2;Rap1欠損Foxp3マウス、Rap1の下流分子kindlin3やtalinの欠損マウスが作成中であり、Treg分化におけるRap1シグナルの影響を検討することができるようになりつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
a) Rap1やその上流および下流のエフェクター分子の欠損マウスや常時活性化型のRap1導入マウス由来の胸腺細胞を用いて胸腺組織内における胸腺細胞の細胞死およびTreg産生のキネティックスを検討する。b)Rap1が関与する胸腺細胞の動態過程を検討するためにはRap1が活性化している細胞や動態の過程を追跡する必要がある。 RalGDS-RBD-GFPは活性化Rap1に結合する蛍光プローブであり、in vitroにおいてはケモカイン刺激により極性を得た細胞の先端の膜や突起に局在する。この蛍光プローブはレンチウイルスを用いて造血幹細胞に感染導入して、その放射線照射したマウスに幹細胞移植することにより胸腺細胞に発現させることができる。この胸腺細胞を用いて胸腺組織内3次元タイムラプスイメージングを行い、胸腺細胞のRalGDS-RBD-GFPの細胞内局在をモニターすることで胸腺組織内のRap1が活性化しうる移動や接着の過程を明らかにする。c)Rap1依存的な胸腺細胞の動態を解析するために、蛍光標識したRap1欠損マウス由来胸腺細胞を用いて胸腺組織内の動態を測定し、Rap1欠損により破綻する移動・接着の過程を検討する。d） Rap1やその下流のエフェクター分子の欠損マウスや常時活性化型のRap1導入マウス由来の胸腺細胞に蛍光バイオセンサーを導入し、アポトーシスや制御性T細胞への分化の過程を追跡する。
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