| 研究課題/領域番号 |
16K08917
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
小口 勝司 昭和大学, 医学部, 名誉教授 (50129821)
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| 研究分担者 |
小山田 英人 昭和大学, 医学部, 助教 (50266160)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 悪性高熱症 / リアノジン受容体1型 / 培養細胞株 / 細胞内Ca2+イメージング |
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| 研究実績の概要 |
悪性高熱症(malignant hyperthermia、MH)患者の臨床症例に報告されている細胞内カルシウム(Ca2+)放出チャンネルであるリアノジン受容体１型(RyR1)遺伝子変異体をテトラサイクリン(Tet)の添加により発現誘導できる培養細胞株を樹立して、対照コントロールとなり得る野生型(wt)RyR1を介した細胞内Ca2+動態と比較するためのハイコンテンツスクリーニング(high contents screening、HCS)により解析するシステムの構築を目指した。
1. Flp-In T-Rexシステム(Invitrogen社)のFRT部位を染色体上に持つHEK293細胞に加えて、培養用ディッシュへの接着能がより強く細胞内Ca2+動態のイメージング操作に適したCHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)細胞においても、FRT部位を有する新たな細胞株を樹立した。
2. 以前の研究課題(H9-10)で構築した「カセット構造化したRyR1cDNA」を1)で樹立したFRT部位を持つ培養細胞に遺伝子導入して、Tet添加により野生型(wt)RyR1発現を誘導できる安定発現細胞株を樹立した。
3. 樹立したwtRyR1発現する細胞株（HEK293細胞、CHO細胞）における細胞内Ca2+動態を顕微鏡一体型ハイコンテンツスクリーニングシステム(HCS、Image XpressMICRO、モレキュラーデバイス社）を用いて、Ca2+蛍光指示薬fura2負荷後に、細胞内Ca2+イメージングにより画像解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究を始めるに当たって、約5000アミノ酸残基から成る巨大なイオンチャンネルであるRyR1をコードする全長cDNAが15000ベースを超える長鎖になるために、培養細胞への遺伝子導入が困難となることが予測されたので、比較的に導入効率の高いとされるHEK293細胞を選択して実験をスタートした。また、RyR1の強い持続的な発現状態は細胞死（アポトーシス）を引き起こす報告があるので、Tet誘導性発現系であるFlp-In T-Rexシステムを用いることとした。この結果で樹立されたTet誘導性RyR1発現293細胞株では、遺伝子導入操作毎の導入・発現の効率のバラ付きが少なくなって、一定量のRyR1発現量を持つ安定細胞株として継代して維持することができるようになった。次に、樹立したTet誘導性RyR1発現293細胞の細胞内Ca2+動態の解析のために、Ca2+蛍光指示薬fura2を負荷して、顕微鏡一体型HCS(Image XpressMICRO、モレキュラーデバイス社）を使って得られた蛍光画像の解析から細胞内Ca2+イメージングを行うことができた。しかし、カフェインなどRyR1刺激薬を添加して測定する際に、HCS機器のプログラムから自動的に添加される溶液の流速(液圧)により、細胞が培養ディッシュから剥離してしまい観測が困難になる場合が多かった。このために、培養ディッシュ接着能がより強く細胞内Ca2+動態のイメージング操作に適すると考えられるCHO(チャイニーズハムスター卵巣由来)細胞にも、FRT部位を有する新たな細胞株を獲得して樹立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、培養用ディッシュ接着能が強く細胞内Ca2+動態のイメージング操作に適すると考えられるCHO細胞(FRT部位を有する)も用いると共に、これまで樹立したHEK293細胞(FRT部位を有する)においても、従来からの顕微測光法にて細胞内Ca2+動態の解析を進める。
RyR1の強い持続的な発現状態は細胞死（アポトーシス）を引き起こすので、Tet誘導性遺伝子発現様ではあるが、TRE3Gプロモーターを持つ単一ベクターで目的遺伝子の発現をTet-Express添加により誘導できるTet-Express誘導性システム(takara-Clontech社)も採用することとした。そのために、pcDNA/FRT(Invitrogen社)のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター部分をTet応答性因子TRE3Gプロモーター(PTRE3G)に置き換えたpcDNA/FRT/TRE3G型ベクターに改良して利用する。
また、販売されているHCSによる細胞内Ca2+動態の画像取得の際に使用する側面が光不透過(ブラック側面)で底面だけが光透過できる透明ガラス底の培養用マルチ(96穴等)プレートには、底面の平面が一定でないものが製品ロットにより頻発したので、販売会社と相談して良いロット番号の製品を、使用期限も考慮しながら、揃える必要があることが判った。
上述と同時に、MHの症例報告にある中で実験的に未確認のRyR1遺伝子の変異体を、以前の研究課題(H9-10)で構築した「カセット構造化したRyR1cDNA」を利用して、順次作製する。
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