| 研究課題/領域番号 |
16K08922
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
大栗 誉敏 崇城大学, 薬学部, 准教授 (70346807)
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| 研究分担者 |
安楽 誠 崇城大学, 薬学部, 教授 (60398245)
中村 仁美 崇城大学, 薬学部, 助教 (60510691)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 抗体医薬品 / Fab / SS結合 / 安定化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ヒトモノクローナル抗体医薬品アダリムマブの抗原結合部位を含んだFabをターゲットとし、アミノ酸変異導入によって高度に安定化し、機能性を高めた改変Fabの作製を目的とする。2018年度では、有用な変異体を得るために、研究実施計画における②ヒトFab定常領域での分子間SS結合導入変異デザインと変異体の調製，③Fab変異体の安定性の評価，を引き続き実施し、⑤動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価，⑥Fabの長期保温による物性評価，⑦Fab変異体へのPEG化と物性評価，について検討した。
これまで、12個の変異体が候補として選出し、それぞれCys導入変異体を作製していた（No1～No12変異体）。これらの変異体は、導入部分でSS結合が形成されていることを解析しやすいように、既存のC末端に存在する分子間SS結合を、Cys→Ala変異により欠損させた。変異体No1,2,9,11においては目的のSS結合形成は見られたものの、未形成の分子種も含まれていた。No3,5,6,12の４つの変異体は完全な新規のSS結合導入に成功し安定化も実証した。さらなる安定化を行うため、野生型のC末SS結合を４つの変異体に導入した多重変異体を作製し酵母から発現させ、精製に成功した。またFabの糖鎖付加体の作製も行い、糖鎖付加による凝集の抑制に成功した。No5について、C末端のH鎖のみCysを持つ変異体を作製しPEG化を試みた。種々の条件検討よりPEG化体の調製に成功した。またラットを使った体内血中時間測定の系も確立させた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度は、⑤動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価、⑥Fabの長期保温による物性評価、⑦Fab変異体へのPEG化と物性評価、の計画を立て検討した。⑦では新規のSS結合を導入したFabのC末端CysへのPEG化に成功した。この変異体を用いて⑤の体内貯留時間を評価するため、ラットを用いて予備実験を実施した。その結果、採血後にELISAで濃度を測定する実験系が確立できた。この系によりPEG化Fabについて評価を行っていく。⑥については37℃での長期保存の途中に蒸発が見られたため、再度条件検討を行っていく。
これまで多くの変異体を作製した結果、新規の分子間SS結合の導入は、困難であることが分かった。しかしその中で、現在、４つ変異体について新規の分子間SS結合形成が確認でき、安定化に成功している。野生型のC末端部分のSS結合を含め、これらの変異部位を重ねることで、高度に耐熱化ができ、目的である機能性を高めた改変Fabの作製が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度では、研究計画②ヒトFab定常領域での分子間SS結合導入変異デザインと変異体の調製，③Fab変異体の安定性の評価、を引き続き継続し安定化Fabを作製していく。また④－⑥の実験も継続して進めていく。そして実験計画⑦を実施する。FabのPEG化は、血中半減期を増加させる効果がある。タンパク質に影響がないよう特異的に修飾する事が重要である。現在、C末端の分子間SS結合を還元し、フリーになったCysへのPEG修飾が報告されているが、我々はC末端のSS結合の解離が不安定化を招くことを実証した。そこで新規分子間SS結合導入変異体であるNo5を用いて、このC末端CysへのPEG修飾を検討した結果、PEG化体の作製に成功した。このPEG化Fabを用いて⑤動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗体医薬品アダリムマブのFabについて、機能性を高めたFabの改変を行っている。2018年度では、ヒトFab変異体のPEG修飾体を調製し、動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価を予定していた。しかし、PEG修飾の条件検討に時間を要したため、動物実験が年度内に終えられない状況となった。PEG修飾の条件は完成しつつあるため、研究期間を延長して次年度に動物実験を行っていくというのが理由である。
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